Stereologisk estimering av kolinerge fiberlengde i nucleus basalis av Meynert av mushjernen
Summary
Neuronal fiber lengde innenfor en tredimensjonal struktur av en hjerneregion er en pålitelig parameter for å kvantifisere spesifikk nevronal strukturell integritet eller degenerasjon. Denne artikkelen beskriver en stereologisk kvantifiseringsmetode for å måle kolinerge fiberlengde innenfor kjernen basalis av Meynert hos mus som et eksempel.
Abstract
Lengden på kolinerge eller andre nevronale aksoner i ulike hjerneregioner er ofte korrelert med den spesifikke funksjonen i regionen. Stereologi er en nyttig metode for å kvantifisere nevronale profiler av ulike hjernestrukturer. Her gir vi en programvarebasert stereologiprotokoll for å estimere den totale lengden på kolinerge fibre i kjernen basalis av Meynert (NBM) av basal forebrain. Metoden bruker en plass ball sonde for lengde estimater. Kolinerge fibre visualiseres av kolin acetyltransferase (ChAT) immunstaining med pepperrot peroksidase-diaminobenzidin (HRP-DAB) deteksjonssystem. Fargeprotokollen er også gyldig for fiber- og cellenummerestimering i ulike hjerneregioner ved hjelp av stereologiprogramvare. Stereologiprotokollen kan brukes til estimering av lineære profiler som kolinoceptive fibre, dopaminerge/ katekollaminerge fibre, serotonergiske fibre, astrocyttprosesser eller til og med vaskulære profiler.
Introduction
Kvantitative estimater av lengde og/eller tetthet av nervefibre i hjernen er viktige parametere for nevropatologiske studier. Lengden på kolinerge, dopaminerge og serotonerge aksoner i ulike hjerneregioner er ofte korrelert med de spesifikke funksjonene i regionen. Fordi fordelingen av disse aksonene generelt er heterogen, brukes designbasert stereologi for å unngå skjevhet under prøvetaking. Romballsonden til stereologi er designet for å gi effektive og pålitelige tiltak av linjelignende strukturer som nevronale fibre i en region av interesse1. Sonden gjør en virtuell sfære som pålegges systematisk i vevet for å måle linjekryss med overflaten av sonden. Fordi det er umulig å sette sfæresonder i vevet for analyse, gir den kommersielt tilgjengelige programvaren en virtuell tredimensjonal (3D) sfære, som i utgangspunktet er en rekke konsentriske sirkler av ulike diametre som representerer overflaten av sfæresonden.
Selektiv kolinerg neurodegenerasjon er en av de konsekvente egenskapene til Alzheimers sykdom (AD)2,3,4. Dysfunksjonell kolinerg overføring regnes som en årsaksfaktor for kognitiv nedgang i AD. Kolinerg dysfunksjon er også tydelig i mange andre psykiske lidelser som Parkinsons, avhengighet og schizofreni. Ulike aspekter ved kolinerg nevrodegenerasjon studeres i dyremodeller (f.eks. reduksjon i acetylkolin5, ChAT protein6, kolinerge fiberneurodegenerasjon i nærheten av amyloid plakk6,og reduksjon i kolinerge fibre og synaptiske varikositeter7,8). Fiberdegenerasjon antas å finne sted tidligere enn nevronalt tap, fordi kolinerge nevronale tap ikke alltid observeres i studier. De fleste kolinerge nevronene er i basal forhjernen og hjernestammen, og deres aksoner projiserer til ulike hjerneregioner som kortices og hippocampus. NBM ligger i basal forebrain og funnet å være en av de allment berørte hjerneområdene i AD.
Den fraksjonatormetoden for stereologi er basert på systematisk tilfeldig prøvetaking av et vev på flere nivåer. Seksjonsprøvefraksjon (SSF) er den ikke-databaserte systematiske prøvetakingen av seksjoner for brøkmetoden for stereologi. Arealprøvetakingsfraksjon (ASF) er fraksjonering av et område av interesseområdet i delen. Tykkelse prøvetaking fraksjon (TSF) er fraksjoneringen av tykkelsen på en seksjon. Plassballsonden gjør det mulig for oss å kvantifisere profiler av interesse i en 3D-sfære på fraksjonerte steder. Her bruker vi en plass ball sonde for estimering av den totale lengden av kolinerge fibre i NBM av musen hjernen for å illustrere prosedyrene. Den nåværende protokollen gir detaljer om vevsbehandling, prøvetakingsmetoder for stereologi, immunohistokjemisk farging ved hjelp av ChAT-antistoffet, og objektiv stereologi for å estimere kolinerg fiberlengde og fibertetthet i NBM av musehjernen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi en metode for å estimere tettheten av kolinerge fibre i NBM ved hjelp av en romkule (sfære) sonde. Denne sonden anslår den totale fiberlengden i området av interesse. Den totale lengden kan deles på volumet av regionen for å få fibertettheten. For å estimere volumet av regionen, ble Cavalieri point count-metoden brukt. Cavalieri point count-metoden er en objektiv og effektiv estimator av et 3D-referansevolum for alle regioner. Metoden beregner et estimat av området på en kuttoverflate av en seksjon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til W.Z.S. fra Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Alzheimers Association (NPSPAD-11-202149), og ressurser fra Midtvesten Biomedical Forskningsstiftelsen.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
Referências
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology–reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
