Длина нейронного волокна в трехмерной структуре области мозга является надежным параметром для количественной оценки конкретных нейрональных структурных целостности или дегенерации. В этой статье подробно стереологический метод количественной оценки для измерения длины холинергического волокна в ядре базалис Мейнерт у мышей в качестве примера.
Длина холинергических или других нейрональных аксонов в различных областях мозга часто коррелирует с конкретной функцией региона. Стереология является полезным методом количественной оценки нейрональных профилей различных структур мозга. Здесь мы предоставляем программно-основанный протокол стереологии для оценки общей длины холинергических волокон в ядре базалис Айнерт (NBM) базального передних мозгов. Метод использует зонд космического шара для оценки длины. Холинергические волокна визуализированы холиновой ацетилтрансферазой (ChAT) иммуностоинг с хреном пероксидаза-диаминобензидин (HRP-DAB) системы обнаружения. Протокол окрашивания также действителен для оценки клетчатки и клеточного номера в различных областях мозга с помощью программного обеспечения стереологии. Протокол стереологии может быть использован для оценки любых линейных профилей, таких как холиноцептивные волокна, дофаминергические/катехоламинговые волокна, серотониновые волокна, астроцитные процессы или даже сосудистые профили.
Количественные оценки длины и/или плотности нервных волокон в головном мозге являются важными параметрами невропатологических исследований. Длина холинергических, дофаминергических и серотонинергических аксонов в различных областях мозга часто коррелирует с конкретными функциями региона. Поскольку распределение этих аксонов, как правило, неоднородно, стереология на основе дизайна используется для предотвращения предвзятости во время отбора проб. Космический шар зонд стереологии был разработан, чтобы обеспечить эффективные и надежные меры линии, как структуры, такие как нейронные волокна в регионе, представляющих интерес1. Зонд делает виртуальную сферу, которая систематически навязывается в ткани для измерения пересечений линий с поверхностью зонда. Поскольку невозможно поместить сферы зондов в ткани для анализа, коммерчески доступное программное обеспечение обеспечивает виртуальную трехмерную (3D) сферу, которая в основном представляет собой ряд концентрических кругов различных диаметров, представляющих поверхность сферного зонда.
Селективная холинергическая нейродегенерация является одной из последовательных особенностей болезни Альцгеймера (AD)2,3,4. Дисфункциональная холинергическая передача считается причинным фактором для когнитивных снижение АД. Холинергическая дисфункция также проявляется во многих других психических расстройствах, таких как болезнь Паркинсона, наркомания и шизофрения. Различные аспекты холинергической нейродегенерации изучаются в животных моделях (например, снижение ацетилхолина5, ChAT белка6, холинергического волокна нейродегенерации в непосредственной близости от амилоидных бляшек6, и снижение холинергических волокон и синаптических варикозы7,8). Дегенерация волокна, как полагают, происходит раньше, чем потеря нейронов, потому что холинергические потери нейронов не всегда наблюдается в исследованиях. Большинство холинергических нейронов находятся в базальном предмозге и стволе мозга, и их аксоны проекта различных областях мозга, таких как кортики и гиппокампа. NBM расположен в базальном предмозге и оказался одним из часто пострадавших областей мозга в AD.
Метод фракционности стереологии основан на систематической случайной выборке ткани на нескольких уровнях. Раздел выборки фракции (SSF) является некомпьютерным основе систематической выборки разделов для фракционного метода стереологии. Фракция выборки (ASF) является фракцией области региона, интересуемого в разделе. Толщина фракции выборки (TSF) является фракция толщины раздела. Космический шар зонд позволяет нам количественно профили интерес в 3D сфере в дробных местах. Здесь мы используем космический шар зонд для оценки общей длины холинергических волокон в NBM мыши мозга, чтобы проиллюстрировать процедуры. Текущий протокол содержит подробную информацию о обработке тканей, методы отбора проб для стереологии, иммуногистохимическое окрашивание с использованием антитела CHAT, и беспристрастной стереологии для оценки длины холинергического волокна и плотности волокна в NBM мыши мозга.
Здесь мы демонстрируем метод оценки плотности холинергических волокон в НБМ с помощью космического шара (сферы) зонда. Этот зонд оценивает общую длину волокна в интересуемом регионе. Общая длина может быть разделена по объему региона, чтобы получить плотность волокна. Для оценки объем?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами W.З.S. от Медицинской службы исследований и разработок, Департамента по делам ветеранов (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Ассоциацией Альцгеймера (NPSPAD-11-202149), и ресурсами из Биомедицинской биомедицины Среднего Запада Научно-исследовательский фонд.
ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |