यहां, एक प्रोटोकॉल एक उतार चढ़ाव परख प्रदर्शन और फेनोटाइपिक मार्कर का उपयोग कर माइक्रोबियल उत्परिवर्तन दर का अनुमान लगाने के लिए प्रस्तुत किया जाता है । यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को विविध रोगाणुओं और वातावरण में उत्परिवर्तन परख करने में सक्षम बनाएगा, यह निर्धारित करेगा कि जीनोटाइप और पारिस्थितिक संदर्भ सहज उत्परिवर्तन दरों को कैसे प्रभावित करते हैं ।
उतार चढ़ाव परख व्यापक रूप से तरल वातावरण में बढ़ रोगाणुओं में उत्परिवर्तन दरों का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । कई संस्कृतियों प्रत्येक कुछ हजार कोशिकाओं के साथ टीका लगाया जाता है, प्रत्येक एक चयनात्मक मार्कर के प्रति संवेदनशील है जिसे आम तौर पर परपर किया जा सकता है। ये समानांतर संस्कृतियां फेनोटाइपिक मार्कर की अनुपस्थिति में कई पीढ़ियों तक बढ़ती हैं। संस्कृतियों के सबसेट का उपयोग उत्परिवर्तनों के जोखिम में कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है (यानी, विकास अवधि के अंत में जनसंख्या का आकार, या एनटी)। शेष संस्कृतियों को चयनात्मक आगर पर चढ़ाया जाता है। समानांतर संस्कृतियों के बीच मनाया प्रतिरोधी म्यूटेंट का वितरण तब गणितीय मॉडल का उपयोग करके म्यूटेशनल घटनाओं की अपेक्षित संख्या का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, एम। एनटी द्वारा एम को विभाजित करना प्रति पीढ़ी प्रति लोकस उत्परिवर्तन दर का अनुमान देता है। परख में तीन महत्वपूर्ण पहलू हैं: चुने हुए फेनोटाइपिक मार्कर, समानांतर संस्कृतियों की चुनी हुई मात्रा, और यह सुनिश्चित करना कि चुनिंदा आगर पर सतह ऊष्मायन से पहले पूरी तरह से सूखी है। परख अपेक्षाकृत सस्ती है और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की जरूरत है । यह वैकल्पिक दृष्टिकोणों की तुलना में भी कम श्रमसाध्य है, जैसे उत्परिवर्तन संचय और एकल-सेल परख। परख जीवों पर काम करता है कि कई पीढ़ियों के माध्यम से तेजी से जाना है और यह मार्कर और सेल मौत के फिटनेस प्रभाव के बारे में मांयताओं पर निर्भर करता है । हालांकि, हाल ही में विकसित उपकरण और सैद्धांतिक अध्ययन का मतलब है कि इन मुद्दों को अब विश्लेषणात्मक रूप से संबोधित किया जा सकता है । परख अलग-अलग जीनोटाइप के साथ कोशिकाओं में विभिन्न फेनोटाइपिक मार्कर के उत्परिवर्तन दर अनुमान की अनुमति देता है जो अलगाव में या समुदाय में बढ़ रहा है। समानांतर में कई परखों का आयोजन करके, परखों का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है कि एक जीव का पर्यावरणीय संदर्भ सहज उत्परिवर्तन दर को कैसे प्रभावित करता है, जो रोगाणुरोधी प्रतिरोध, कैंसरजन्य, उम्र बढ़ने और विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
1 9 01 में डच वनस्पतिविज्ञानी ह्यूगो डी वेरियों ने उत्परिवर्तनशब्द गढ़ा1. छब्बीस साल बाद, जब हरमन जोसेफ मुलर ने एक्स-रे2की उत्परिवर्ती कार्रवाई की खोज की, तो उत्परिवर्तन ों को पहले से ही विकास की ड्राइविंग ताकतों में से एक माना जाता था। हालांकि म्यूटेशन की प्रकृति स्पष्ट नहीं थी। इस मूलभूत प्रश्न का उत्तर देने के लिए कि क्या उत्परिवर्तन अनायास उभरते हैं (यानी, एक सहज उत्परिवर्तन) या चयन (यानी, एक प्रेरित उत्परिवर्तन) के जवाब में, उत्परिवर्तनीय घटनाओं का निरीक्षण करने के लिए एक विधि की आवश्यकता थी। इस तरह की विधि से प्रति सेल डिवीजन म्यूटेशन की अपेक्षित संख्या या जिसे पहले से ही म्यूटेशन रेट3,4के रूप में जाना जाता था , को मापना होगा ।
चित्रा 1: कैसे एक ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली में एक माइक्रोबियल तनाव के साथ उतार चढ़ाव परख प्रदर्शन करने के योजनाबद्ध उदाहरण । (क)50 मीटर ट्यूबों में टीका और एक्लाइमेट कोशिकाओं जिसमें पांच अलग-अलग वातावरण (‘लाल’, ‘नीला’, ‘हरा’, ‘बैंगनी’, और ‘नारंगी’ परस शामिल हैं)। (ख)एक ९६ गहरी अच्छी थाली में संवेदनशील कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के साथ समानांतर संस्कृतियों तैयार करते हैं । ‘लाल’ परख में 20 समानांतर संस्कृतियां हैं, जबकि ‘नीला’, ‘हरा’, ‘बैंगनी’, और ‘नारंगी’ परख सभी के पास 19 समानांतर संस्कृतियां हैं। ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली पर समानांतर संस्कृतियों की स्थिति यादृच्छिक हैं । रैंडमाइजेशन अनुपूरक लेआउटजेनरेटर.आर स्क्रिप्ट या किसी अन्य उपकरण के साथ किया जा सकता है। शीर्ष दाईं ओर लेआउट यादृच्छिक परिणाम है। (ग)96 डीप वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें और कोशिकाओं को विभाजित करने और अनायास रूपांतरित करने की अनुमति दें। गहरे कुओं A1, B1, C1, E1, F1, और G1 से छह संस्कृतियों से पता चलता है कि कैसे म्यूटेंट की संख्या में उतार चढ़ाव: 4, 0, 2, 2, 1, और तीसरे सेल डिवीजन के बाद 4 लाल कोशिकाओं, क्रमशः । म्यूटेंट की संख्या न केवल सहज उत्परिवर्तनों की विभिन्न संख्या (0, 1, या 2 के रूप में पहले लाल कोशिका द्वारा दिखाया गया है) के कारण अलग है, बल्कि इसलिए भी कि यह महत्वपूर्ण है जब संस्कृति चक्र के दौरान एक प्रतिरोध उत्परिवर्तन अनायास उभर ताहै (सेल डिवीजन 1, 2, या 3)। (D)96 डीप वेल प्लेट के ऊष्मायन के बाद म्यूटेंट की संख्या 81 समानांतर संस्कृतियों को चढ़ाना द्वारा निर्धारित की जाती है। लेआउट पर ये बोल्ड किनारों के बिना सर्कल हैं। पूरी समानांतर संस्कृति एक चयनात्मक आगर युक्त एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं पर चढ़ाया जाता है । (ई)शेष 15 संस्कृतियों को कोशिकाओं की औसत संख्या(एनटी)निर्धारित करने के लिए गैर-चयनात्मक आगर पर पतला और चढ़ाया जाता है । लेआउट पर इन्हें एनटीवेल्स के रूप में चिह्नित किया जाता है और किनारों को बोल्ड किया जाता है। प्रत्येक परख एनटी के लिए तीन समानांतर संस्कृतियों पर औसत है । नीचे दाईं ओर एक पेट्री डिश है जिसमें एक गैर-चयनात्मक आगर प्लेट है जिसमें एक गहरी अच्छी तरह से डी 1 (एक ‘ ग्रीन ‘ परख का हिस्सा) में उगाई जाने वाली पतला संस्कृति के 25 CFUs के साथ एक गैर-चयनात्मक आगर प्लेट है। (एफ)चयनात्मक 6 अच्छी प्लेटों के ऊष्मायन के बाद मनाए गए म्यूटेंट की संख्या गिनी गई और म्यूटेशनल घटनाओं की अपेक्षित संख्या, एम,अधिकतम संभावना अनुमानक का उपयोग करके अनुमान लगाया गया था। (जी)उत्परिवर्तन, एमऔर परख, एनटीप्रति कोशिकाओं की संख्या दोनों को जानते हुए भी उत्परिवर्तन दर का अनुमान एम/एनटीके रूप में लगाया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
1 9 43 में साल्वाडोर लुरिया और मैक्स डेलब्रुक ने उतार-चढ़ाव परख5 (देखें चित्रा 1)के साथ इस समस्या का एक सरल समाधान प्रदान किया। परख कई आबादी (समानांतर संस्कृतियों नाम) के साथ शुरू होती है जो माइक्रोबियल कोशिकाओं की एक छोटी संख्या(चित्रा 1ए, बी)के साथ शुरू की जाती है। सौम्य, गैर-चयनात्मक वातावरण(चित्रा 1सी)में वृद्धि के बाद, समानांतर संस्कृतियों को चुनिंदा मार्कर (फेज, एंटीबायोटिक्स, आदि) वाली प्लेटों पर स्थानांतरित किया जाता है, जहां प्रतिरोध उत्परिवर्तन वाली केवल कोशिकाएं जीवित रहती हैं और एक कॉलोनी(चित्रा 1डी)का उत्पादन कर सकती हैं। मुख्य अपेक्षा यह थी कि यदि प्रतिरोध उत्परिवर्तन प्रेरित होते हैं, तो उत्परिवर्तन करने वाली कोशिकाओं की संख्या को विचरण के बराबर औसत के साथ विभिन्न आबादी के बीच वितरित किया जाना चाहिए। लुरिया और डेलब्रुक ने उतार-चढ़ाव परख के साथ क्या पाया है कि म्यूटेंट की संख्या में काफी उतार-चढ़ाव आया और विभिन्न आबादी के बीच म्यूटेंट की संख्या में भिन्नता मतलब से काफी अधिक थी। लुरिया और डेलब्रुक ने इस तरह दिखा दिया कि उत्परिवर्तन सहज हैं। उन्होंने दिखाया कि जब भी डीएनए की प्रतिकृति होती है तो उत्परिवर्तन अनायास ही उभर ते हैं और जनसंख्या के विकास के दौरान उत्परिवर्तन कब होता है, म्यूटेंट की संख्या इस बात पर निर्भर करती है । चित्रा 1सीदेखें, जहां छह आबादी, प्रत्येक माइक्रोबियल सेल (नीले रंग में) के साथ शुरू की गई, कोई भी, 1 या 2 एकल म्यूटेशन का अनुभव नहीं करती है। आबादी A1, E1, और F1 एक एकल उत्परिवर्तन (पहली लाल सेल) का अनुभव है, लेकिन क्योंकि एक एकल उत्परिवर्तन अनायास एक संस्कृति चक्र के दौरान विभिंन समय बिंदुओं पर उभर, आबादी मनाया म्यूटेंट (चार, दो, और एक, क्रमशः) की एक बहुत अलग संख्या के साथ समाप्त हो गया । दूसरी ओर, आबादी C1 और G1 E1 और A1 के रूप में मनाया म्यूटेंट की एक ही संख्या के साथ समाप्त हो गया, दो म्यूटेशन घटनाओं के बजाय एक का अनुभव करने के बावजूद । आबादी के बीच मनाया म्यूटेंट के उतार-चढ़ाव ने न केवल परख का नाम दिया, बल्कि यह भी दिखाया कि उत्परिवर्ती आवृत्ति (यानी, उत्परिवर्ती कोशिकाओं का अनुपात) उत्परिवर्तन दर का अपर्याप्त संकेतक है।
उतार-चढ़ाव परख का समग्र लक्ष्य एक विशेष तरल वातावरण में बढ़ रहे बैक्टीरिया या अन्य एकल-कोशिकीय जीव के एक विशेष जीनोटाइप की सहज उत्परिवर्तन दर का अनुमान लगाना है। उतार चढ़ाव परख माइक्रोबियल उत्परिवर्तन दरों की पर्यावरण निर्भरता का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त उपकरण बना हुआ है और तेजी से और सस्ती उत्परिवर्तन दर अनुमान की अनुमति देता है । उत्परिवर्तन दर अनुमान के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण, जैसे अधिकतम गहराई अनुक्रमण6,जनसंख्या अनुक्रमण7,उत्परिवर्तन संचय प्रयोग8,या माता-पिता9 के लिए एक संतान के जीनोम दृश्यों की तुलना करना बहुत अधिक श्रमसाध्य है, और इस प्रकार संभावित रूप से पर्यावरणीय निर्भरता का पता लगाने के लिए खराब अनुकूल है। हालांकि, उत्परिवर्तन की पीढ़ी और मरम्मत के गतिशील पहलू काफी हद तक उतार-चढ़ाव परख या ऊपर सूचीबद्ध उत्परिवर्तन दर को परखने के तरीकों में से किसी के लिए दुर्गम हैं। अध्ययन करने के लिए कैसे समय, अंतरिक्ष, या एक जनसंख्या के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच में परिवर्तन की संख्या, एकल सेल11,12 दृष्टिकोण आवश्यक हैं, जो उतार चढ़ाव परख से अधिक श्रमसाध्य होने के अलावा, अत्यधिक विशेष कौशल और उपकरणों की आवश्यकता है ।
व्यवहार में, एक उतार चढ़ाव परख एक उत्परिवर्तन है कि एक है कि मार्कर के लिए चयन की कमी वातावरण में होता है के कारण एक फेनोटाइपिक मार्कर प्राप्त कोशिकाओं की गिनती है । प्रकाशित परख ों के सैकड़ों के मेटा विश्लेषणसे पता चलता है कि १९४३ में परख की स्थापना के बाद से कम से ३९ विभिन्न फेनोटाइपिक मार्कर का इस्तेमाल किया गया है । उतार चढ़ाव परख का उपयोग प्रयोगशाला, नैदानिक, नॉनम्यूटेंटर और स्वतंत्र वातावरण में बढ़ रहे म्यूटेटर उपभेदों के बीच उत्परिवर्तन दरों के औसत और पर्यावरणीय निर्भरता की तुलना करने के लिए किया जा सकता है। परख या तो ंयूनतम या समृद्ध वातावरण में बढ़ रही विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ कोशिकाओं में उत्परिवर्तन दर अनुमान के लिए अनुमति देता है। परख न केवल एक मोनोकल्चर के रूप में बढ़ रही आबादी के लिए उपयुक्त है, लेकिन यह भी उत्परिवर्तन दरों11पर सेल सेल बातचीत के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जब ब्याज के तनाव को दूसरे तनाव के साथ सहसंस्कारित किया जाता है, और उपभेदों को अलग करने के लिए एक तटस्थ मार्कर का उपयोग किया जाता है, तो उत्परिवर्तन दरों को एक ही समय में एक ही ट्यूब में दो उपभेदों के लिए परख दिया जा सकता है।
उतार-चढ़ाव के परखों से पता चला है कि सहज उत्परिवर्तन दर एक सेल के जीनोटाइप और उसके पर्यावरण12 दोनों पर निर्भर करती है और यह एक विशेषता है जो खुद13विकसित होती है । जब भी एक विशेष जीनोटाइप की उत्परिवर्तन दर पर्यावरण के साथ बदलती है, तो इसे म्यूटेशन-रेट प्लास्टिसिटी11के रूप में वर्णित किया जाता है । प्लास्टिक उत्परिवर्तन दरों को तनाव से प्रेरित म्यूटाजेनेसिस (सिम)14के लिए सबसे अच्छी तरह से संबोधित किया गया है । इसके अलावा, उतार-चढ़ाव परख ों का उपयोग करते हुए, हाल ही में यह दिखाया गया है कि जिस घनत्व से कोशिकाओं की आबादी बढ़ती है (आमतौर पर क्षमता में एक बैच संस्कृति) बैक्टीरिया और एककोशिकीय यूकेरियोट्स में उत्परिवर्तन दरों से निकटता से जुड़ी होती है। प्रति पीढ़ी प्रति जीनोम उत्परिवर्तन दर घने आबादी में 23 गुना10,11तक कम हो जाती है . यह घनत्व से संबंधित उत्परिवर्तन दर प्लास्टिसिटी (डीएएमपी) कोरम-सेंसिंग सिस्टम15 पर निर्भर कर सकती है और सिम16से स्वतंत्र रूप से कार्य कर सकती है।
यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक ग्लूकोज ंयूनतम मीडिया वातावरण में एंटीबायोटिक रिफाम्पिसिन के लिए प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल उतार चढ़ाव परख के लिए प्रस्तुत किया है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल को एक बुनियादी टेम्पलेट के रूप में देखा जाना चाहिए जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के रोगाणुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है ताकि केवल संस्कृति की स्थिति और उत्परिवर्तन के फेनोटाइपिक मार्कर को संशोधित किया जा सके। यह प्रोटोकॉल अपनीस्थापना5,17, 18,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29 से विकसित हुआ है, इसके उपयोग के माध्यम से रोगाणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला और यहां तक कि कैंसर कोशिकाओंको 30 पर संशोधित किया गया है और इसे बढ़ाने के लिए संशोधित किया गया है थ्रूपुट, जो माइक्रोबियल म्यूटेशनदरों 10,11,16के पर्यावरणनिर्भरता ठीक से परीक्षण के लिए आवश्यक था . यहां वर्णित प्रोटोकॉल में उतार-चढ़ाव परख के सभी पद्धतिगत और विश्लेषणात्मक मुद्दों को शामिल नहीं किया गया है जो साहित्य में पहले से ही अच्छी तरह से चर्चा कर चुके हैं, विशेष रूप से प्रतिरोधी उत्परिवर्तनों के फिटनेस प्रभाव31,फेनोटाइपिक देरी32,सेल डेथ33,और उत्परिवर्तन दरों का अनुमान लगाने के लिए उपलब्ध विभिन्न एल्गोरिदम की उपयुक्तता26,34। उदाहरण के लिए, यह महत्वपूर्ण हो सकता है, जब फिटनेस प्रभावों की पर्यावरणीय निर्भरता उत्परिवर्तन दरअनुमानों 35में गलत भिन्नता को जन्म दे सकती है। हालांकि, हम ध्यान दें कि विश्लेषणात्मक उपकरण है कि हम यहां का उपयोग उत्परिवर्ती फिटनेस और सेल मौत में भिन्नता से निपटसकते हैं । जैसा कि नोटों और चर्चा में संबोधित किया गया है, यह भी सिफारिश की जाती है कि कई फेनोटाइपिक मार्कर जो पर्यावरण की दृष्टि से निर्भर फिटनेस प्रभाव ों पर विचार करने की संभावना नहीं है। यह प्रोटोकॉल लोगों को नियमित रूप से माइक्रोबियल उपभेदों और वातावरण की विविधता में उत्परिवर्तन दरों की पर्यावरणीय निर्भरता परख लगाने में सक्षम बनाएगा । विभिन्न वातावरणों में उत्परिवर्तन ों को अभी तक अच्छी तरह से परीक्षण नहीं किया गया है और एक बार जनसंख्या घनत्व पर विचार किया जाता है, उतार-चढ़ाव परख उत्परिवर्तन दर10का अधिक सटीक अनुमान दे सकते हैं । यह प्रोटोकॉल अधिक उतार-चढ़ाव वाले परखों को पूरा करने में सक्षम बनाएगा, जैसा कि उत्परिवर्तन दरों को रेखांकित करने वाले तंत्रों को समझने के लिए आवश्यक है, जो बदले में विकास, कैंसरजन्य, उम्र बढ़ने और रोगाणुरोधी प्रतिरोध को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
उत्परिवर्तन दर के किसी भी अनुमान के लिए34अध्ययनों के भीतर और बीच में दोहराव और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए प्राप्त परिशुद्धता को अधिकतम करने की आवश्यकता होती है । एक उतार चढ़ाव परख के लिए, वहां तीन महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । पहले दो दिए गए प्रोटोकॉल में स्थापित किया गया है, लेकिन समस्या निवारण की आवश्यकता होगी (चित्रा 3देखें) अगर प्रोटोकॉल विभिन्न उपभेदों या वातावरण के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया जाता है । सबसे पहले उपयुक्त फेनोटाइपिक मार्कर चुनना है। बैक्टीरिया के लिए, क्रमशः एंटीबायोटिक दवाओं रिफाम्पिकिन और नैलिडिक्सिक एसिड के प्रतिरोध को प्रदान करते हुए, दो मार्कर लोकी, आरपीओबी या जायरामें से एक पर दरों का अनुमान लगाने की सिफारिश की जाती है। इन दोनों लोकी पर एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए उत्परिवर्तन के लिए लक्ष्य आकार अलग है । क्रमशः रिफामिपिसिन37 और नैलिडिक्सिक एसिड 40 के प्रतिरोध को प्रदान करने वाले 79 और20 अद्वितीय उत्परिवर्तन हैं। व्यवहार में, इसका मतलब यह है कि औसतन, रिफाम्पिकिन प्रतिरोधी म्यूटेंट अधिक बार मनाए जाते हैं। तो, पहला सवाल (चित्रा 3में Q1) है कि जवाब देने की जरूरत है या नहीं तनाव एक उत्परिवर्ती है । जब संविलियन म्यूटेटर का अध्ययन किया जाता है, जहां कई देखे गए उत्परिवर्ती उपनिवेशों की उम्मीद की जाती है, तो छोटे लक्ष्य आकार (जैसे, नैलिडिक्सिक एसिड) के साथ मार्कर का उपयोग करना बेहतर होता है। देखें चित्रा 2बी,जहां संविलियन म्यूटर ई कोलाई के-12 BW25113की उत्परिवर्तन दरों का अनुमान एक मार्कर के रूप में नैलिडिक्सिक एसिड का उपयोग कर रहा था । नॉनम्यूटेटर बैक्टीरियल उपभेदों के साथ काम करते समय जिनमें जंगली प्रकार (यानी सामान्य) उत्परिवर्तन दर होती है, रिफामपिसिन एक बेहतर विकल्प है (चित्रा 2एदेखें)। यदि किसी कारण से अधिक देखे गए म्यूटेंट की आवश्यकता होती है, तो एक प्रासंगिक मार्कर एक साइक्लोजिन का प्रतिरोध है। इस मार्कर के लिए, प्रतिरोध उत्परिवर्तन दस से अधिक जीन41में उभर सकते हैं, जिसका अर्थ है कि लक्ष्य का आकार रिफाम्पिसिन की तुलना में भी बड़ा है। खमीर और आर्काया का अध्ययन करते समय 25S राइबोसोमल प्रोटीन और URA3 में उत्परिवर्तन दरों का अनुमान लगाने की सिफारिश की जाती है, जो क्रमशः हाइग्रोमाइसिन बी और 5-फ्लोरो-ऑरोटिक एसिड (5-FOA) के प्रतिरोध प्रदान करता है।
दूसरा महत्वपूर्ण विचार समानांतर संस्कृतियों की मात्रा है । उपयोग करने के लिए कौन सी मात्रा देखी गई म्यूटेंट की वास्तविक संख्या पर निर्भर करती है। मनाया म्यूटेंट की अपेक्षित संख्या चुने हुए फेनोटाइपिक मार्कर के लिए लक्ष्य आकार, म्यूटेशन (औसत उत्परिवर्तन दर) की मरम्मत और बचने की तनाव की क्षमता और पर्यावरण की वहन क्षमता से प्रभावित होती है, जो मीडिया द्वारा उपयोग किए गए और संस्कृति की मात्रा दोनों से प्रभावित होती है। यदि कोई समानांतर संस्कृतियों में रिफ्मेपिसिन के प्रतिरोधी उत्परिवर्ती उपनिवेश होते हैं, तो साइक्लोजिन का उपयोग किया जाना चाहिए या प्लेटेड कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि की जानी चाहिए। यह एक न्यूनतम माध्यम के लिए और अधिक ग्लूकोज जोड़कर या एक अमीर (या पूरा) वातावरण में कोशिकाओं को बढ़ाकर प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, कई मामलों में, जनसंख्या घनत्व में इस तरह की वृद्धि उत्परिवर्तन दर में कमी के साथ जुड़ी हुई है, जिसके परिणामस्वरूप सीमित, यदि कोई हो, उत्परिवर्ती कॉलोनियों की संख्या में वृद्धि10देखी गई । यदि पोषक तत्वों को बढ़ाना कोई समाधान नहीं है, तो प्रत्येक समानांतर संस्कृति की मात्रा में वृद्धि करके कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि एक विकल्प है। जब पर्यावरण में कार्बन और ऊर्जा के एकमात्र स्रोत के रूप में चीनी के साथ न्यूनतम लवण शामिल होते हैं (यानी, चित्रा 3 में Q2 का उत्तर “न्यूनतम माध्यम” है), तो 0.5 और 1.5 mL के बीच की मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि पर्यावरण समृद्ध है, तो समानांतर संस्कृतियों की मात्रा 0.35−1 मिलील के बीच होनी चाहिए। अंतिम प्रश्न प्रतिरोधी कॉलोनियों की औसत संख्या से संबंधित है। यदि बहुत कम उत्परिवर्ती उपनिवेशों को देखा जाता है (यानी, चित्रा 3 में Q3 का उत्तर 0 है) और पर्यावरण को संशोधित नहीं किया जाना चाहिए, तो समानांतर संस्कृतियों की मात्रा को बढ़ाया जाना चाहिए या एक बड़े लक्ष्य आकार (जैसे, cycloserine) के साथ एंटीबायोटिक का उपयोग किया जाना चाहिए। दूसरी ओर, यदि सभी चयनात्मक प्लेटों (प्रति प्लेट ~ 150 से अधिक) पर बहुत सारी उत्परिवर्ती उपनिवेशों को देखा जाता है, तो चित्रा 3देखें), तो प्लेटेड कोशिकाओं की संख्या में कमी की जानी चाहिए, जिसका अर्थ है आमतौर पर कम मात्रा का उपयोग करना या छोटे लक्ष्य आकार (जैसे, नैलिडिक्सिक एसिड) के साथ एंटीबायोटिक पर स्विच करना।
एक बार मात्रा चुना जाता है, यह सबसे अच्छा है कि एक ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली पर सभी समानांतर संस्कृतियों एक ही मात्रा है । कि थाली के वजन से समानांतर संस्कृतियों की वास्तविक मात्रा के अधिक सटीक निर्धारण की अनुमति देता है । जब किसी विशेष जीनोटाइप की उत्परिवर्तन दरों की तुलना विभिन्न वातावरणों के बीच की जाती है, तो सभी वातावरणों में समानांतर संस्कृतियों की समान मात्रा का उपयोग करना फिर से सबसे अच्छा होता है। यदि नालिडिक्सिक एसिड का उपयोग जंगली प्रकार (यानी सामान्य) उत्परिवर्तन दरों या कुछ अन्य फेनोटाइपिक मार्कर का आकलन करने के लिए किया जाता है जिसका उपयोग किया जाता है जिसमें नैलिडिक्सिक एसिड की तुलना में एक भी छोटा लक्ष्य आकार होता है, तो मात्रा को और भी अधिक बढ़ाया जाना चाहिए। एक विकल्प के लिए 15 mL तक की मात्रा के साथ ५० mL ट्यूबों में समानांतर संस्कृतियों बनाने के लिए है । उदाहरण के लिए, 10 मिलीग्राम समानांतर संस्कृतियों को 50 मिलीग्राम ट्यूबों में तैयार किया गया था जब ई कोलाई के-12 MG1655 उत्परिवर्तन दर का अनुमान लगाते समय नैलिडिक्सिक एसिड (चित्रा 2एदेखें)। समानांतर 10 मीटर संस्कृतियों तो चयनात्मक टीए आगर पर चढ़ाया गया और मानक ९० मिमी पेट्री व्यंजन के बजाय बड़ी १५० मिमी प्लेटों में डाला । 50 एमएल ट्यूबों में समानांतर संस्कृतियों को तैयार करने का नकारात्मक पक्ष यह है कि थ्रूपुट 96 गहरी अच्छी प्लेट में उत्परिवर्तन दरों को परसने की तुलना में काफी कम है। एक समाधान समानांतर संस्कृतियों की संख्या को कम करना है। हालांकि, यह एमके अनुमान के लिए सटीकता को प्रभावित करेगा, जो उत्परिवर्तनीय घटनाओं की अपेक्षित संख्या और समानांतर संस्कृतियों की संख्या26पर निर्भर करता है। 14−17 समानांतर संस्कृतियों के साथ मनाया म्यूटेंट का वितरण प्राप्त करना (जैसा कि चित्रा 2में किया गया था), एक ठोस थ्रूपुट और 20% के एक स्वीकार्य सटीक स्तर26 के बीच एक अच्छा संतुलन है। 17.5% का औसत सटीक स्तर 16.4% (5.7%−38.9%, n = 580) की एक इंटरक्वार्टाइल रेंज के साथ औसत परिशुद्धता के समान है, जिसकी गणना10बहुत बड़े डेटा सेट से की जाती है। इस प्रकार, यह सिफारिश की जाती है कि 96 गहरी अच्छी प्लेटों या 50 मीटर ट्यूबों में समानांतर संस्कृतियों को तैयार करते समय देखा म्यूटेंट का वितरण कम से कम 14 समानांतर संस्कृतियों के साथ प्राप्त किया जाता है। जब उत्परिवर्तन दरों का अनुमान विभिन्न वातावरणों में किया जाता है तो मल्टीप्लेट प्रयोग करके सटीक स्तर का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है, जहां एक प्लेट पर सभी 96 समानांतर संस्कृतियां एक ही वातावरण में उगाई जाती हैं। इसके अलावा, समानांतर संस्कृतियों को तैयार करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि इनोकुला में कोशिकाओं की कम संख्या होती है, क्योंकि यह किसी भी प्रतिरोधी कोशिकाओं के इनोकुलम में मौजूद होने की संभावना को कम कर देता है। पहले से मौजूद प्रतिरोधी म्यूटेंट इनोकुलम में नहीं चाहते हैं, क्योंकि वे संख्या में वृद्धि करेंगे और चयनात्मक प्लेटों पर लॉन बनाएंगे और उत्परिवर्तन दर का अनुमान संभव नहीं होगा। उदाहरण के लिए, अधिकांश नॉनम्यूटेंटर ई. कोलाई आबादी में, रिफामपिसिन प्रतिरोध के लिए उत्परिवर्तन दर ~ 10-8 के क्रम में है। इस प्रकार, पहले से मौजूद प्रतिरोधी उत्परिवर्ती के साथ संस्कृति को टीका लगाने से बचने के लिए, किसी को 10 से कम8 कोशिकाओं (जैसे, 103−104 कोशिकाओं) के साथ टीका लगाना चाहिए। अंतिम महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि चुनिंदा आगर प्लेटों को इनक्यूबेटेड करने से पहले, चयनात्मक आगर पर सतह पूरी तरह से सूखी है। स्प्रेडर्स का उपयोग नहीं किया जा सकता है यदि 6-अच्छी प्लेटों का उपयोग किया जाता है और समानांतर संस्कृति की प्रारंभिक मात्रा 1 मिलीहै, उदाहरण के लिए। प्लेटों को बाँझ परिस्थितियों में खुला छोड़ दिया जाना चाहिए ताकि सतह तरल सूख जाए। समय यह लेता है अत्यधिक चर, परिवेश की स्थिति और प्लेटों की स्थिति पर निर्भर हो सकता है । इस समय को कम किया जाना चाहिए लेकिन कई घंटे तक हो सकता है।
उतार-चढ़ाव परख में अंतर्निहित बाधाएं हैं । यह केवल जीनोम के एक छोटे से सबसेट में उत्परिवर्तन के फेनोटाइपिक मार्कर परख करता है। इस प्रकार परख के लिए बड़ी आबादी की आवश्यकता होती है जो पर्याप्त संख्या में पीढ़ियों से गुजरती है ताकि दर का अनुमान लगाने के लिए पर्याप्त उत्परिवर्तन का निरीक्षण किया जा सके। इसका मतलब यह है कि उतार चढ़ाव परख केवल उन जीवों पर इस्तेमाल किया जा सकता है जो बैक्टीरिया, बेकर के खमीर42,या तरल संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं30की तरह तेजी से बड़ी संख्या में पीढ़ियों के माध्यम से जाने में सक्षम हैं। इसके अलावा, म्यूटेशन किसी विशेष कोशिका की विशिष्ट जैव रासायनिक परिस्थितियों में होने वाली दुर्लभ घटनाएं हैं। तथ्य यह है कि उतार चढ़ाव परख समय के साथ कोशिकाओं की बड़ी आबादी भर में देखो का मतलब है कि उन परिस्थितियों में काफी अंतर कर सकते हैं । इस परख का उपयोग करके, अंतराल चरण से प्रारंभिक और देर से घातीय चरण और अंत में एक स्थिर चरण तक किसी विशेष आबादी की उत्परिवर्तन दरों की प्रगति का अध्ययन करना मुश्किल है। जनसंख्या के भीतर एकल कोशिकाओं के बीच उत्परिवर्तन दरों का कोई भी भेदभाव पूरी तरह से उतार-चढ़ाव परख से छिपा हुआ है। एकल कोशिका उत्परिवर्तन गतिशीलता डीएनए मरम्मत प्रोटीन MutS४३ के एक एकल अणु ट्रैकिंग के साथ या संचित MutL प्रोटीन४४के foci गिनती के साथ अध्ययन किया जा सकता है । उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण में हाल की प्रगति ने माता-पिता-संतान तिकड़ी9,45 और बहुपीढ़ी वंशावली46से उत्परिवर्तन दरों का सीधा अनुमान लगाना भी संभव बना दिया है। इस तरह के पद्धतिगत अग्रिम एक ही पीढ़ी के भीतर होने वाले उत्परिवर्तनों की सीधी गिनती की अनुमति देने लगे हैं। हालांकि, इस प्रत्यक्ष दृष्टिकोण को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, माइक्रोफ्लूइडिक्स, या पूरे जीनोम अनुक्रमण जैसी महंगी और अत्याधुनिक प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, उतार चढ़ाव परख अपेक्षाकृत सस्ती है और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण की जरूरत है । अधिक उतार-चढ़ाव वाले परखों को करने से उपन्यास परिकल्पनाओं की पीढ़ी को भी सुविधा होगी, जिनका परीक्षण अधिक प्रत्यक्ष एकल-कोशिका दृष्टिकोणों के साथ किया जा सकता है।
म्यूटेशन के अध्ययन में लंबे समय से रुचि है, इसलिए उतार-चढ़ाव परख की संभावना एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि रहेगी। पिछले 4 वर्षों (2015-2018) में लुरिया और डेलब्रुक5 द्वारा मौलिक कागज के प्रशस्ति पत्रों की संख्या सभी इस पेपर के प्रशस्ति पत्र के लिए शीर्ष पांच में से एक रही है। हालांकि, एक उतार चढ़ाव परख को ठीक से बाहर ले जाने के लिए आवश्यक सटीक मैनुअल काम की एक बड़ी राशि के कारण, अधिकांश अध्ययन केवल मुट्ठी भर उतार-चढ़ाव परख का संचालन करते हैं। हालांकि, यह उत्परिवर्तन दर की पर्यावरणीय निर्भरता को प्रकट करने के लिए अपर्याप्त है। मल्टीवेल प्लेटों का उपयोग करके उतार-चढ़ाव के परखों को सुव्यवस्थित करके, जैसा कि इस पेपर में समझाया गया है, वर्तमान अधिकतम थ्रूपुट संभव है 11 गहरी अच्छी तरह से प्लेटें (५५ उतार-चढ़ाव परख) समानांतर में, जैसा कि यहां वर्णित है । उतार चढ़ाव के दो सेट चल रहा है समानांतर में एक दिन से कंपित, प्रति सप्ताह ११० परख तक ले जाने की अनुमति देता है । थ्रूपुट में एक और कदम परिवर्तन अभी तक विशुद्ध रूप से मैनुअल प्रोटोकॉल से उतार चढ़ाव परख के विभिन्न चरणों को स्वचालित करके संभव हो सकता है। साथ ही, उत्परिवर्तन दर की पर्यावरणीय निर्भरताओं का अध्ययन करने के लिए जनसंख्या घनत्व को ध्यान में रखने की आवश्यकता है । पिछले परिणाम10 से पता चलता है कि जब ज्ञात कारकों कि उत्परिवर्तन दर को प्रभावित करने के लिए हिसाब कर रहे हैं, जनसंख्या घनत्व के लिए नियंत्रित उत्परिवर्तन दर अनुमानों में भिन्नता ९०% से अधिक कम कर सकते हैं । घनत्व को नियंत्रित करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि एनटी (उत्परिवर्तन दर का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है) जनसंख्या घनत्व निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि से स्वतंत्र रूप से निर्धारित किया जाए। बैक्टीरिया में, एनटी CFU और घनत्व द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक एटीपी आधारित ल्यूमिनेसेंस परख10के साथ ।
उच्च थ्रूपुट और नियंत्रण घनत्व दोनों आवश्यक हैं जब अध्ययन कैसे एक जीव के पारिस्थितिक संदर्भ सहज उत्परिवर्तन दर को प्रभावित करता है । उत्परिवर्तन दर प्लास्टिसिटी के अस्तित्व को जानना महत्वपूर्ण है, लेकिन इसके कारणों और प्रभावों को समझना महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं जिन्हें पूरा करने की आवश्यकता है यदि उत्परिवर्तन दर प्लास्टिसिटी को व्यापक जैविक संदर्भ में शामिल किया जाना है। उतार-चढ़ाव परख एक महान उपकरण है जिसका उपयोग कई परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, क्योंकि परिणाम तेजी से प्राप्त किए जाते हैं, और परख अन्य तरीकों के सापेक्ष सस्ती होती है। उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल समुदायों और माइक्रोबायोम में उत्परिवर्तन दर की पर्यावरणीय निर्भरताका अध्ययन करने के लिए चरण निर्धारित किया गया है। सहसंस्कृतियों के लिए उतार चढ़ाव परख अनुकूल परिकल्पना है कि उपभेदों छोटे अणुओं के माध्यम से एक दूसरे के उत्परिवर्तन दरों को प्रभावित परीक्षण कर सकते हैं । सहसंस्कृतियों के साथ उतार चढ़ाव परख के हजारों कर निर्धारित कर सकते है अगर उपभेदों दोनों को एक दूसरे के उत्परिवर्तन दरों को संशोधित करने की क्षमता में बदलती है और उनकी संवेदनशीलता में उनके उत्परिवर्तन दर दूसरों के द्वारा संशोधित किया है । शायद उत्परिवर्तन दर हेरफेर के लिए संवेदनशीलता में उपभेदों के बीच भिन्नता विशिष्ट आनुवंशिक भिन्नता के कारण है । यह कैसे विकास जटिल समुदायों में काम करता है पर हमारे विचारों को बदल सकते हैं, इस तरह के रूप में व्यापक महत्व के उदाहरण में कम नहीं कैसे रोगाणुरोधी प्रतिरोध उभर ।
The authors have nothing to disclose.
आरके को बीबी/M020975/1 और यूनिवर्सिटी ऑफ मैनचेस्टर स्कूल ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज ने सपोर्ट किया । एचआर को बीबी/जे01478/1 ने सपोर्ट किया । GG BBSRC डॉक्टरेट प्रशिक्षण भागीदारी बीबी/M011208/1 द्वारा समर्थित था । डीआरजी को यूकेआरआई अवार्ड नंबर एमआर/आर024936/1 ने सपोर्ट किया ।
1.5 ml Microcentrifuge tubes | Starlab International GmbH | S1615-5550 | |
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | T8877-10g | |
6-well plates | Greiner Bio-One | REF 657102 | |
90mm Petri Dishes Triple Vented | ThermoFisher Scientific | REF 120189 | |
96 deep-well plate (Masterblock 2 ml) | Greiner Bio-One | REF 780270 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A/6440/53 | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | REF 214010 | |
Bacto yeast extract | Becton, Dickinson and Company | REF 212750 | |
Cycloserine | Sigma-Aldrich | 1158005-250MG | Only for assaying an alternative phenotypic marker |
D-Glucose anhydrous | Fisher Chemical | G/0500/61 | |
50 ml Centrifuge Tube | Corning | REF 430828 | |
L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256-500g | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Chemical | M/1050/53 | |
Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878-5G | Only for assaying an alternative phenotypic marker |
Potassium phosphate dibasic trihydrate | Sigma-Aldrich | P5504-500g | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500g | |
Rifampicin | EMD Millipore Corp, USA | 557303-1GM | |
Sodium chloride | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
Spectophotometer | Jenway | 6320D | |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625-25g | |
Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804-500g | |
Tryptone | Fisher Chemical | 1278-7099 |