Expressie, zuivering en liposoom binding van ontluikende gist SNX-BAR Heterodimers
Summary
Hier presenteren we een workflow voor de expressie, zuivering en liposoom binding van SNX-BAR heterodimers in gist.
Abstract
SNX-BAR eiwitten zijn een evolutionair gekonveerde klasse van membraan remodellering eiwitten die belangrijke rollen spelen bij het sorteren en handel in eiwitten en lipiden tijdens endocytose, sorteren binnen het endosomale systeem en autophagie. Centraal in de SNX-BAR proteïne-functie is de mogelijkheid om homodimers of heterodimers te vormen die de membranen binden met sterk geconcongeerde phox-homologie (PX) en BAR (bin/Amphiphysin/RVS) domeinen. Bovendien kan oligomerisatie van SNX-Bar Dimeren op membranen de vorming van membraan tubuli en blaasjes opwekken en deze activiteit wordt verondersteld hun functies als vacht eiwitten voor endosome-afgeleide transport dragers weer te geven. Onderzoekers hebben lang gebruikt in vitro bindende studies met behulp van recombinant SNX-BAR eiwitten op synthetische liposomen of gigantische unilamellaire blaasjes (Guv’s) om de precieze make-up van lipiden die nodig zijn om membraan remodellering te stimuleren onthullen, dus onthullen hun werkingsmechanisme. Echter, als gevolg van technische uitdagingen met dubbele expressie systemen, toxiciteit van SNX-Bar eiwit expressie in bacteriën, en slechte oplosbaarheid van individuele SNX-Bar eiwitten, de meeste studies tot nu toe hebben onderzocht SNX-Bar homodimers, met inbegrip van niet-fysiologische Dimeren die vormen tijdens de expressie in bacteriën. Onlangs hebben we een protocol geoptimaliseerd om de grote tekortkomingen van een typisch bacteriële expressie systeem te overwinnen. Met behulp van deze workflow laten we zien hoe we grote hoeveelheden SNX-BAR heterodimers kunnen uitdrukken en zuiveren en hoe ze deze kunnen reconstitueren op synthetische liposomen voor bindende en tubulatie testen.
Introduction
Aan het membraan gebonden organellen zoals het plasma membraan, het endoplasmatische reticulum, het Golgi-apparaat, lysosoom (gist vacuole) en endosome omvatten het endomembraansysteem-systeem van de eukaryote cel. De meeste organellen hebben de mogelijkheid om via blaasje transporteurs materiaal met andere organellen te communiceren en uit te wisselen. Hoe de cel de verpakking en de vorming van blaasje transport dragers binnen het endomembraansysteem-systeem coördineert, is niet goed begrepen. Echter, de eiwitten en lipiden die een groot deel van het endomembraansysteem-systeem vormen, zijn bekend dat ze afkomstig zijn van het internaliseren van endocytische blaasjes uit het plasma membraan (PM). De endosome is de primaire acceptor organel voor deze blaasjes en bestaat uit meerdere onderling verbonden sets van buisvormige organellen. De belangrijkste functie van de endosome is het vergemakkelijken van nutriënten verwerving, reguleren van de omzet van eiwitten en lipiden, beschermen tegen pathogenen infectie, en dienen als de primaire bijvullen bron van lipiden voor het plasma membraan. Omdat de endosome het grootste deel van de lading eiwitten en lipiden uit het plasma membraan ontvangt, fungeert het als een sorteer compartiment door cargo’s te isoleren in tubulaire endosomale transport dragers (ETCs). Alle eiwitten die niet in ETCs worden opgenomen, worden afgebroken via het Endo-lysosomale systeem. De disregulatie van de lading sortering in ETCS kan leiden tot het verlies van nutriëntenopname, eiwit omzet of lipide homeostase, resulterend in talrijke metabole, ontwikkelings-en neurologische aandoeningen1,2. Ondanks de centrale rol van ETCs bij de endosome, is het onderliggende mechanisme van de manier waarop de endosome de verpakking van een veelheid van heterogene cargo’s selectief kunnen coördineren in buisvormige dragers, echter niet bekend.
Het sorteren van nexin (SNX) familie is een evolutionair gekonveerde klasse van eiwitten die zijn gebleken kritisch te zijn voor vele blaasje transport reacties in de cel3,4,5. Het sorteren van nexins wordt gerekruteerd naar het endogeen membraan en hulp bij het opvangen van de lading via hun karakteristieke phox homologie (PX) domein, dat phosphatidylinositol-3-monofosfaat bindt (PtdIns (3) P), een lipide verrijkt op het endoeen membraan. Zoogdieren coderen 33 SNX-eiwitten, die verder kunnen worden onderverdeeld in meerdere subfamilies, afhankelijk van de aanwezigheid van andere domeinen1. Met name de SNX-BAR subfamilie is de grootste onderfamilie bestaande uit twaalf mensen, terwijl in ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae, de onderfamilie wordt gereduceerd tot slechts zeven SNX-BARs. SNX-BAR eiwitten hebben zowel een PX domein als een bin-Amphiphysin-RVS (BAR) domein dat lipide reservoirs activeert om positieve kromming membranen te binden. Bijgevolg heeft de SNX-BAR familie een natuurlijke affiniteit voor de endosome en kan ze de vorming van ETC bemedieren via hun membraan remodellering capaciteiten. In vitro kunnen de verbouwingen van SNX-BARs worden geïnduceerd door de toevoeging van gezuiverde SNX-staven aan synthetische liposomen en de daaropvolgende vorming van smalle, gecoate tubuli kan worden gevisualiseerd door elektronenmicroscopie. Met behulp van deze methoden, onderzoekers hebben vastgesteld dat beide oligomerisatie concentratie en vernauwing sterkte lijken te variëren tussen de SNX-Bar familie suggereren dat ze konden helpen in zowel de vorming en de scissie van ETCS.
De SNX-BARs kunnen verder worden geclassificeerd door hun exclusieve door dimerisatie-eigenschappen. In vitro binding testen en structurele studies hebben aangetoond dat SNX-BAR eiwitten alleen specifieke homodimers of heterodimers kunnen vormen. Daarom, in principe, elke potentiële SNX-BAR dimer-oligomeren zou kunnen bieden een tubulus Coat voor een Cargo-specifieke handel traject en ook, de beperkte oligomerisatie van de andere SNX-BAR protomers, kunnen definiëren verschillende export trajecten. Echter, vanwege het grote aantal SNX-BARs en diversiteit binnen de SNX-familie, is een één Sorteer nexin-One Cargo hypothese hoogst onwaarschijnlijk. In plaats daarvan een gecoördineerde inspanning met behulp van een veelheid van factoren, zoals SNX-BARs, lading, lipide specificiteit en andere afhankelijkheden is waarschijnlijker. Evenzo, recente studies van de gist SNX4 familie geopenbaard bewijs voor extra lipide specificiteit, buiten PtdIns (3) P, te versterken endosome transport dragers6. In deze studie, SNX-Bar homodimer Mvp1-Mvp1 werd gezuiverd van bacteriën en inheemse heterodimers Snx4-Atg20 en Vps5-Vps17 werden uitgedrukt en gezuiverd in hoge opbrengst van gist, terwijl alleen Snx4-Atg20 werd gevonden om bij voorkeur binden fosfatidylserine (PS) en vormen smalle buis-achtige structuren in liposoom bindende studies6. Terwijl anderen in het veld hebben onthuld belangrijke eigenschappen van de SNX-BARs met behulp van recombinantly gezuiverde SNX-Bar homodimers van bacteriën, toxiciteit in verband met uitdrukken SNX-Bar heterodimers in vergelijkbare systemen hebben hun inheemse karakterisering7,8,9,10belemmerd. Daarom, zonder een betrouwbaar systeem te verkrijgen zuivere recombinantly uitgedrukt inheemse heterodimers, onderzoekers moeten afzien van deze onderzoekslijnen. In Figuur 1presenteren we een vierdelige workflow aan 1) om een gist-stam te maken die de SNX-Bar heterodimers overdrukt voor het zuiveren van tandem-affiniteit, 2) Express en zuiveren inheemse SNX-Bar heterodimers, 3) bereid unilamellaire synthetische liposomen, en 4) opzetten van een liposoom tubulatie of sedimentaties Assay, het verstrekken van een essentieel instrument voor onderzoekers om de groeiende catalogus van het sorteren nexins gevonden in de natuur te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier demonstreren we een geoptimaliseerde workflow om SNX-Bar Dimeren in gist te zuiveren en twee testen om hun biofysische eigenschappen op synthetische liposomen te evalueren. Het belangrijkste voordeel ten opzichte van typische recombinant eiwit expressie in Escherichia coli of andere systemen is het vermogen om SNX-Bar eiwitten gelijkmatig te uiten in een inheemse gastheer, waardoor de toxiciteit en onoplosbaarheid problemen in zuiverende SNX-staven in andere systemen worden vermeden. Het is ook opmerkelijk …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder het awardnummer GM060221 en deels door het Nationaal Instituut voor algemene medische wetenschappen van de nationale instituten van de gezondheid onder het gunnings nummer T32GM007223. R.C. werd deels gesteund door het UNC-Charlotte Faculty Research Grants-programma.
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
Referências
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
