अभिव्यक्ति, शुद्धि, और नवोदित खमीर SNX-बार Heterodimers के Liposome बाध्यकारी
Summary
यहां, हम खमीर में SNX-बार विषमता की अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और लिपोसोम बाइंडिंग के लिए एक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
एसएनएक्स-बार प्रोटीन झिल्ली रीमॉडलिंग प्रोटीन का एक विकासवादी रूप से संरक्षित वर्ग है जो एंडोसाइटोसिस के दौरान प्रोटीन और लिपिड की छंटाई और तस्करी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, एंडोसोमल प्रणाली के भीतर छंटाई, और ऑटोफैगी। सेंट्रल टू एसएनएक्स-बार प्रोटीन फंक्शन होमोडिमर्स या हेटेरोडिमर बनाने की क्षमता है जो अत्यधिक संरक्षित फोक्स-होमोलॉजी (पीएक्स) और बार (बिन/एम्फीफिसिन/आरवीएस) डोमेन का उपयोग करके झिल्ली को बांधते हैं । इसके अलावा, झिल्ली पर एसएनएक्स-बार डिमरकाकरण झिल्ली ट्यूबल और वेसिकल्स के गठन को प्रकाश में लासकता है और इस गतिविधि को एंडोसोम-व्युत्पन्न परिवहन वाहकों के लिए कोट प्रोटीन के रूप में उनके कार्यों को प्रतिबिंबित करने के लिए सोचा जाता है। शोधकर्ताओं ने लंबे समय से सिंथेटिक liposomes या विशाल unilamellar vesicles (GUVs) पर recombinant SNX-बार प्रोटीन का उपयोग कर में इन विट्रो बाध्यकारी अध्ययनका उपयोग किया है झिल्ली remodeling ड्राइव करने के लिए आवश्यक लिपिड के सटीक श्रृंगार प्रकट करने के लिए, इस प्रकार कार्रवाई के अपने तंत्र का खुलासा । हालांकि, दोहरी अभिव्यक्ति प्रणालियों के साथ तकनीकी चुनौतियों के कारण, बैक्टीरिया में एसएनएक्स-बार प्रोटीन अभिव्यक्ति की विषाक्तता, और व्यक्तिगत एसएनएक्स-बार प्रोटीन की खराब घुलनशीलता, आज तक के अधिकांश अध्ययनों ने एसएनएक्स-बार होमोडोर्स की जांच की है, जिसमें बैक्टीरिया में अभिव्यक्ति के दौरान फार्म का गैर-शारीरिक डिमर शामिल है। हाल ही में, हमने एक विशिष्ट जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणाली की प्रमुख कमियों को दूर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का अनुकूलन किया है। इस कार्यप्रवाह का उपयोग करके, हम प्रदर्शित करते हैं कि बड़ी मात्रा में एसएनएक्स-बार हेटेरोडिमर्स को सफलतापूर्वक कैसे व्यक्त और शुद्ध किया जाए और उन्हें बाध्यकारी और ट्यूबुलेशन परख के लिए सिंथेटिक लिपोसोम पर कैसे पुनर्गठित किया जाए।
Introduction
झिल्ली से बंधे ऑर्गेनेल्स जैसे प्लाज्मा झिल्ली, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, गोल्गी उपकरण, लासोसोम (खमीर वैक्यूल), और एंडोसोम में यूकेरियोटिक सेल की एंडोम्मेम्ब्रेन सिस्टम शामिल है। अधिकांश ऑर्गेनेल्स में वेसिकल परिवहन वाहकों के माध्यम से अन्य ऑर्गेनेल्स के साथ सामग्री का संचार और आदान-प्रदान करने की क्षमता होती है। कैसे सेल पैकेजिंग और एंडोम्मेब्रेन प्रणाली के भीतर वेसिकल परिवहन वाहक के गठन का समन्वय अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है । हालांकि, एंडोम्मेम्ल सिस्टम का अधिकांश गठन करने वाले प्रोटीन और लिपिड प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) से एंडोसाइटिक वेसिकल्स को आंतरिक करने से उत्पन्न होने के लिए जाने जाते हैं। एंडोसोम इन वेसिकल्स के लिए प्राथमिक स्वीकारकर्ता ऑर्गेनेल है और इसमें ट्यूबलर ऑर्गेनेल्स के कई परस्पर सेट शामिल हैं। एंडोसोम का मुख्य कार्य पोषक तत्वों के अधिग्रहण की सुविधा, प्रोटीन और लिपिड कारोबार को विनियमित करना, रोगजनक संक्रमण से बचाना और प्लाज्मा झिल्ली के लिए लिपिड के प्राथमिक भरपाई स्रोत के रूप में काम करना है। चूंकि एंडोसोम प्लाज्मा झिल्ली से कार्गो प्रोटीन और लिपिड के थोक प्राप्त करता है, यह ट्यूबलर एंडोसोमल परिवहन वाहक (ईटीसी) में कार्गो को अलग करके एक छंटाई डिब्बे के रूप में कार्य करता है। ईटीसी में तनहा नहीं होने वाले किसी भी प्रोटीन को एंडो-लाइसोसोमल सिस्टम के माध्यम से अपमानित करने के लिए छोड़ दिया जाता है । ईटीसी में कार्गो छंटाई के डिस्रेगुलेशन से पोषक तत्वों के तेज, प्रोटीन टर्नओवर या लिपिड होमोस्टोसिस की हानि हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप कई मेटाबोलिक, विकासात्मक और न्यूरोलॉजिकल विकार1,2हो सकते हैं। हालांकि, एंडोसोम में ईटीसीएस केंद्रीय भूमिका के बावजूद, कैसे एंडोसोम चुनिंदा ट्यूबलर वाहकों में विषम कार्गो की एक भीड़ की पैकेजिंग का समन्वय कर सकते है की अंतर्निहित तंत्र ज्ञात नहीं है ।
छंटाई नेक्सिन (एसएनएक्स) परिवार प्रोटीन का एक विकासवादी रूप से संरक्षित वर्ग है जो सेल3,4,5में कई वेसिकल परिवहन प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण पाया गया है। छंटाई नेक्सिन को एंडोसोम झिल्ली में भर्ती किया जाता है और उनकी विशेषता फोक्स होमोलॉजी (पीएक्स) डोमेन के माध्यम से कार्गो कैप्चर में सहायता की जाती है, जो फोस्फेटिडिलिओसिटोल-3-मोनोफॉस्फेट (पीटीडीइन्स (3)पी) को बांधती है, जो एंडोसोम झिल्ली पर समृद्ध एक लिपिड है। स्तनधारी ३३ SNX प्रोटीन को एन्कोड करते हैं, जिन्हें अन्य डोमेन1की उपस्थिति के अनुसार कई उपपरिवारों में विभाजित किया जा सकता है । सबसे विशेष रूप से, SNX-बार उपपरिवार सबसे बड़ा उपपरिवार है जिसमें मानव में बारह शामिल हैं, जबकि नवोदित खमीर में, सैचारोमाइसेस सेरेविसियामें, उपपरिवार सिर्फ सात SNX-BARs तक कम हो जाता है। एसएनएक्स-बार प्रोटीन में पीएक्स डोमेन और बिन-एम्फीफिसिन-आरवीएस (बार) डोमेन दोनों होते हैं जो लिपिड जलाशयों को सकारात्मक वक्रता झिल्ली को बांधने के लिए ट्रिगर करता है। नतीजतन, SNX-बार परिवार के एंडोसोम के लिए एक प्राकृतिक लगाव है और उनकी झिल्ली remodeling क्षमताओं के माध्यम से ईटीसी गठन मध्यस्थता कर सकते हैं । विट्रो में, एसएनएक्स-बीएआरएस के रीमॉडलिंग गुणों को सिंथेटिक लिपोसोम्स के लिए शुद्ध एसएनएक्स-बीएआरएस के अलावा प्रेरित किया जा सकता है और बाद में संकीर्ण, लेपित ट्यूबल के गठन की कल्पना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा की जा सकती है। इन तरीकों का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने निर्धारित किया है कि दोनों oligomerization एकाग्रता और कसना शक्ति SNX-बार परिवार के बीच बदलती है सुझाव है कि वे दोनों गठन और ETCs के कैंची में सहायता कर सकता है दिखाई देते हैं ।
एसएनएक्स-बीएआरएस को उनके अनन्य डामरीकरण गुणों द्वारा आगे वर्गीकृत किया जा सकता है। इन विट्रो बाध्यकारी परखों और संरचनात्मक अध्ययनों से पता चला है कि एसएनएक्स-बार प्रोटीन केवल विशिष्ट होमोडिमर्स या हेट्रोडोर बना सकते हैं। इसलिए, सैद्धांतिक रूप से, प्रत्येक संभावित एसएनएक्स-बार डिमर-ओलिगोमर कार्गो-विशिष्ट तस्करी मार्ग के लिए एक ट्यूबल कोट प्रदान कर सकता है और इसी तरह, अन्य एसएनएक्स-बार प्रॉटोमर का प्रतिबंधित अल्पाचारण, विशिष्ट निर्यात मार्गों को भी परिभाषित कर सकता है। हालांकि, SNX-BARs और SNX परिवार के भीतर विविधता की बड़ी संख्या के कारण, एक छंटाई नेक्सिन-एक कार्गो परिकल्पना बहुत संभावना नहीं है । इसके बजाय SNX-BARs, कार्गो, लिपिड विशिष्टता और अन्य निर्भरता जैसे कारकों की एक भीड़ का उपयोग कर एक समन्वित प्रयास अधिक संभावित है । इसी तरह, खमीर SNX4 परिवार के हाल के अध्ययनों से पता चला अतिरिक्त लिपिड विशिष्टता के लिए सबूत, PtdIns (3) पी से परे, एंडोसोम परिवहन वाहक6शक्तिशाली करने के लिए । इस अध्ययन में, एसएनएक्स-बार होमोडिमर एमवीपी1-एमवीपी 1 को बैक्टीरिया और देशी हेटेरोडिमर्स Snx4-Atg20 और Vps5-Vps17 से शुद्ध किया गया था, जबकि केवल Snx4-Atg20 को तरजीही रूप से फॉस्फेटिफायर (पीएस) और प्रूलोसोमअध्ययनमें संकीर्ण ट्यूब जैसी संरचनाओं को तैयार करने के लिए पाया गया था । जबकि क्षेत्र के अन्य लोगों ने बैक्टीरिया से पुनः शुद्ध एसएनएक्स-बार होमोडिमर्स का उपयोग करके एसएनएक्स-बीएआरएस के महत्वपूर्ण गुणों का खुलासा किया है, इसी तरह की प्रणालियों में एसएनएक्स-बार हेटेरोडिमर्स व्यक्त करने से जुड़ी विषाक्तता ने उनके मूल लक्षण वर्णन7,8,9,10में रुकावट पैदा की है। इसलिए, शुद्ध पुनः रूप से व्यक्त देशी विषमता प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय प्रणाली के बिना, शोधकर्ताओं को जांच की इन पंक्तियों को त्याग ना करना चाहिए। चित्रा 1में, हम 1 के लिए एक चार भाग कार्यप्रवाह पेश करते हैं) एक खमीर तनाव का निर्माण करते हैं जो मिलकर आत्मीयता शुद्धि के लिए SNX-बार विषमता पर अधिक व्यक्त करता है, 2) व्यक्त और शुद्ध देशी SNX-बार विषमता, 3) unilamellar सिंथेटिक liposomes तैयार करते हैं, और 4) एक liposome ट्यूबुलेशन या तलछट परख की स्थापना की, शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करने के लिए प्रकृति में पाया छंटाई नेक्सिन की बढ़ती सूची की जांच ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम खमीर में SNX-बार डिमर्स को शुद्ध करने के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह प्रदर्शित करते हैं और सिंथेटिक लिपोसोम पर उनके जैव भौतिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए दो परख देते हैं। एस्चेरिचिया कोलाई</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए अनुसंधान को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय आयु र्इंध संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या GM060221 के तहत और राष्ट्रीय संस्थानों के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा भाग में समर्थन दिया गया था पुरस्कार संख्या T32GM007223 के तहत स्वास्थ्य की । आर सी को यूएनसी-शार्लोट फैकल्टी रिसर्च ग्रांट प्रोग्राम द्वारा भाग में समर्थन दिया गया था ।
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
Referências
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
