Uttryck, rening, och Liposom bindning av spirande jäst SNX-BAR heterodimers
Summary
Här presenterar vi ett arbetsflöde för uttrycket, rening och Liposom bindning av SNX-bar heterodimerer i jäst.
Abstract
SNX-BAR proteiner är en evolutionärt bevarad klass av membran remodeling proteiner som spelar nyckelroller i sortering och handel med protein och lipider under endocytos, sortering inom endosomalt system, och autofagi. Central till SNX-bar proteinfunktion är förmågan att bilda homodimers eller heterodimerer att binda membran med mycket bevarade phox-Homology (px) och bar (bin/amphiphysin/RVS) domäner. Dessutom kan oligomerisering av SNX-bar dimerer på membran framkalla bildandet av membran tubuli och blåsor och denna verksamhet tros återspegla deras funktioner som päls proteiner för endosome-härledda transport bärare. Forskare har länge utnyttjat in vitro-bindande studier med hjälp av rekombinanta SNX-bar proteiner på syntetiska liposomer eller Giant små blåsor (guvs) att avslöja den exakta makeup av lipider behövs för att driva membran remodeling, vilket avslöjar deras verkningsmekanism. Men på grund av tekniska utmaningar med dubbla uttrycks system, toxicitet av SNX-bar proteinuttryck i bakterier, och dålig löslighet av enskilda SNX-bar proteiner, de flesta studier hittills har undersökt SNX-bar homodimers, inklusive icke-fysiologiska dimerer som bildas under uttryck i bakterier. Nyligen har vi optimerat ett protokoll för att övervinna de stora bristerna i ett typiskt bakteriellt uttrycks system. Med hjälp av detta arbetsflöde, visar vi hur man framgångsrikt uttrycka och rena stora mängder SNX-bar heterodimerer och hur man rekonstituerar dem på syntetiska liposomer för bindning och tubulation assays.
Introduction
Membran-bundna organeller såsom plasmamembranet, endoplasmatiska reticulum, den Golgi apparaten, Lysosomen (jäst vacuole), och endosome utgör endomembrane systemet i eukaryotiska cellen. De flesta organeller har förmågan att kommunicera och utbyta material med andra organeller genom vesikel transport bärare. Hur cellen samordnar förpackningen och bildandet av vesikel transport bärare inom endomembrane systemet är inte väl förstått. Emellertid, de proteiner och lipider som utgör mycket av den endomembrane systemet är kända för att komma från internalisera rutt blåsor från plasmamembranet (PM). Den endosome är den primära acceptor organell för dessa vesikler och består av flera sammankopplade uppsättningar av rörformiga organeller. Den huvudsakliga funktionen av endosome är att underlätta näringsämne förvärv, reglera protein och lipid omsättning, skydda mot patogener infektion, och att fungera som den primära påfyllning källa av lipider för plasmamembranet. Eftersom endosome tar emot merparten av Last proteiner och lipider från plasmamembranet, fungerar den som ett sorteringsfack genom att isolera Cargos till rörformiga endosomala transport bärare (ETCs). Alla proteiner som inte binds in i ETCs är kvar att brytas ned via endo-lysosomalt system. Dysregleringen av Last sortering i ETCS kan leda till förlust av näringsupptag, protein omsättning eller lipidhomeostas, vilket resulterar i många metabola, utvecklingsmässiga och neurologiska störningar1,2. Trots en central roll för ETCs på endosome är den bakomliggande mekanismen för hur endosome selektivt kan samordna förpackningen av en mängd heterogena laster i rörformiga bärare inte känd.
Den sortering nexin (SNX) familjen är en evolutionärt bevarad klass av proteiner som har visat sig vara kritiska för många vesikel transport reaktioner i cellen3,4,5. Sortering nexins rekryteras till endosome membranet och stöd i Last fångst via deras karakteristiska phox homologi (px) domän, som binder fosfatidylinositol-3-monofosfat (ptdins (3) P), en lipid berikad på endosome membranet. Däggdjur koda 33 SNX proteiner, som kan delas upp ytterligare i flera underfamiljer, beroende på närvaron av andra domäner1. Framför allt är SNX-BAR under familj den största underfamiljen bestående av tolv i mänskliga, medan i spirande jäst, Saccharomyces cerevisiae, underfamiljen reduceras till bara sju SNX-barer. SNX-BAR proteiner har både en PX-domän och en bin-Amphiphysin-RVS (BAR) domän som utlöser lipid reservoarer för att binda positiva krökning membran. Följaktligen har SNX-BAR familjen en naturlig affinitet för endosome och kan medla ETC formation via deras membran remodeling förmågor. In vitro, den remodeling egenskaper SNX-barer kan induceras genom tillsats av renade SNX-barer till syntetiska liposomer och efterföljande bildandet av smala, belagda tubuli kan visualiseras genom elektronmikroskopi. Med hjälp av dessa metoder, forskare har fastställt att både oligomerisering koncentration och sammandragning styrka verkar variera bland SNX-bar familj tyder på att de kunde stöd i både bildandet och uppdelning av ETCS.
SNX-staplarna kan klassificeras ytterligare genom sina exklusiva Dimerization egenskaper. In vitro bindnings analyser och strukturella studier har visat att SNX-BAR-proteiner endast kan bilda specifika homodimers eller heterodimers. Därför i princip kan varje potentiell SNX-bar dimer-Oligomer ge en tubuli päls för en Last-specifik handel väg och likaså den begränsade oligomerisering av andra SNX-bar protomers, kan också definiera distinkta export vägar. Men på grund av det stora antalet SNX-barer och mångfald inom SNX familjen, en en sortering nexin-en Last hypotes är högst osannolikt. Istället en samordnad ansträngning med hjälp av en mängd faktorer såsom SNX-barer, Last, lipid specificitet och andra beroenden är mer sannolikt. Likaså avslöjade nyare studier av jästen SNX4 familj bevis för ytterligare lipid specificitet, bortom PtdIns (3) P, att potentiera endosome transport bärare6. I denna studie, SNX-bar homodimer Mvp1-Mvp1 renades från bakterier och infödda heterodimerer Snx4-Atg20 och Vps5-Vps17 uttrycktes och renas i hög avkastning från jäst, medan endast Snx4-Atg20 konstaterades att företrädesvis binda Fosfatidylserin (PS) och bilda smala rör-liknande strukturer i Liposom bindande studier6. Medan andra på fältet har avslöjat viktiga egenskaper SNX-barer med recombinantly renade SNX-bar homodimers från bakterier, toxicitet i samband med att uttrycka SNX-bar heterodimerer i liknande system har hindrat deras inhemska karakterisering7,8,9,10. Därför, utan ett tillförlitligt system för att få ren recombinantly uttryckt infödda heterodimers, forskare måste avstå från dessa linjer av utredning. I figur 1, presenterar vi en fyrdel arbetsflöde till 1) konstruera en jäst stam överuttrycker SNX-bar heterodimerer för tandem affinitetsrening, 2) uttrycka och rena infödda SNX-bar heterodimerer, 3) förbereda små syntetiska liposomer, och 4) inrätta en Liposom tubulation eller sänkor analys, vilket ger ett viktigt verktyg för forskare att undersöka den växande katalog av sortering nexins finns i naturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här demonstrerar vi ett optimerat arbetsflöde för att rena SNX-bar dimerer i jäst och två analyser för att utvärdera deras biofysiska egenskaper på syntetiska liposomer. Den största fördelen jämfört med typiskt rekombinant proteinuttryck i Escherichia coli eller andra system är förmågan att jämnt uttrycka SNX-bar proteiner i en infödd värd, vilket undviker toxicitet och olöslighet problem som finns i renande SNX-barer i andra system. Det är också anmärkningsvärt att vårt system inte kräv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper vid National Institutes of Health under tilldelning nummer GM060221 och delvis av det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper av de nationella instituten Hälsotillstånd under tilldelnings nummer T32GM007223. RC stöddes delvis av UNC-Charlotte fakultetens forskningsstipendium program.
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
Referências
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
