Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

Resumo

Migração de células coletivas em desenvolvimento, cicatrização de feridas e metástase oncológica é muitas vezes guiada pelos gradientes de fatores de crescimento ou moléculas de sinalização. Descrito aqui é um sistema experimental que combina microscopia de tração com um sistema microfluídico e uma demonstração de como quantificar a mecânica da migração coletiva gradiente bioquímico.

Resumo

As células alteram os padrões de migração em resposta a estímulos químicos, incluindo os gradientes dos estímulos. A migração celular na direção de um gradiente químico, conhecida como quimiotaxia, desempenha um papel importante no desenvolvimento, na resposta imune, na cicatrização de feridas e na metástase do câncer. Enquanto a quimiotaxia modula a migração de células simples, bem como coleções de células in vivo, in vitro pesquisa centra-se em quimiotaxis de uma única célula, em parte devido à falta de ferramentas experimentais adequadas. Para preencher essa lacuna, descrita aqui é um sistema experimental único que combina microfluídica e micropadronização para demonstrar os efeitos de gradientes químicos na migração de células coletivas. Além disso, a microscopia de tração e a microscopia de estresse monocamada são incorporadas ao sistema para caracterizar mudanças na força celular no substrato, bem como entre as células vizinhas. Como prova de conceito, a migração de ilhas circulares micromodeladas de células de rim canino Madin-Darby (MDCK) é testada um gradiente de fator de crescimento de hepatócitos (HGF), um fator de espalhamento conhecido. Encontra-se que as pilhas situadas perto da concentração mais elevada de HGF migram mais rapidamente do que aquelas no lado oposto dentro de uma ilha da pilha. Dentro da mesma ilha, a tração celular é semelhante em ambos os lados, mas o estresse intercelular é muito menor no lado da maior concentração de HGF. Este novo sistema experimental pode proporcionar novas oportunidades para estudar a mecânica da migração quimotáxica por coletivas celulares.

Introdução

A migração celular em sistemas biológicos é um fenômeno fundamental envolvido na formação de tecidos, na resposta imune e na^{cicatrização de feridas1,2,3}. A migração celular também é um processo importante em algumas doenças como o câncer⁴. As células geralmente migram como um grupo em vez de individualmente, o que é conhecido como migração de célula coletiva^4,5. Para que as células se movam coletivamente, a detecção do microambiente é essencial⁶. Por exemplo, as células ....

Protocolo

Nota: litografia de moldes SU-8 para Estênceis (espessura = 250 μm) e partes de microcanais (espessura = 150 μm), gravura em vidro (profundidade = 100 μm) e fabricação de elenco foram terceirizadas enviando projetos usando software de design assistido por computador para os fabricantes.

1. fabricação do estêncil do polidimetilsiloxano (PDMS) e do Microchannel

1. Projete o micropadrão do estêncil e do microchannel.
2. Fabricar ou terceirizar os moldes SU-8 (espessura de ~ 250 μm para stencils e ~ 150 μm para microcanais) em wafers de silício (4 "de diâmetro).
3. Prepare a mistura de PDMS misturando o elastómetro baixo e ....

Resultados

Para explorar a migração coletiva gradiente químico, foi integrado um sistema microfluídico com microscopia de tração (Figura 1). Para construir o sistema integrado, o gel do poliacrilamida (PA) foi fundido no vidro do costume-corte, e as pilhas de MDCK foram semeadas dentro das Ilhas micromodeladas feitas por um estêncil de PDMS. Para este experimento, foram criadas doze ilhas de células MDCK (quatro fileiras por três colunas, diâmetro de ~ 700 μm). Após células anexadas a géis PA, o estênc.......

Discussão

A migração coletiva das células constituintes é um processo importante durante o desenvolvimento e a regeneração, e a direção migratória é muitas vezes guiada pelo gradiente químico dos fatores de crescimento^4,23. Durante a migração coletiva, as células mantêm a interação com células vizinhas e substratos subjacentes. Tais interações mecânicas dão origem a fenômenos emergentes, como durotaxis⁴², plithotaxis³³e kenot.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% de tripsina-EDTA (1X)	Gibco	25200-056
Solução tampão HEPES 1 M	Gibco	15630-056
Punção de biópsia de 1 mm	Integra Miltex	33-31AA-P/25
Placas de Petri de 100 mm	SPL	10100 100	mm de diâmetro, 15 mm de altura
14 mm de punção oca	ILJIN	124-0571
18 mm Ø Lamínula	Marienfeld-Superior	111580	Circular 18 mm, espessura nº 1 (0,13 a 0,16 mm)
Solução de bisacrilamida a 2%	Bio-Rad	1610142	Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos.
3-(Trimetoxissilil)metacrilato de propila (TMSPMA)	Sigma-Aldrich	440159-500ML
torneira de 3 vias	Hyupsung	HS-T-61N	CUIDADO: não use se tiver sido aberto anteriormente. não reesterilizar ou reutilizar
linha de volume mínimo de 30 cm (para pediátrica)	Hyupsung	HS-MV-30	CUIDADO: não use se tiver sido aberto anteriormente. não reesterilizar ou reutilizar
placa de cultura de células de 35 mm	Corning
Solução de Acrilamida a 40%	Bio-Rad	1610140	Use luvas, roupas e proteção para os olhos.
Linha de volume mínimo de 75 cm (para pediatria)	Hyupsung	HS-MV-75	CUIDADO: não use se tiver sido aberto anteriormente. não reesterilizar ou reutilizar
ácido acético	J.T. Baker	JT9508-03
Persulfato de amônio (APS)	Bio-Rad	1610700
Antibiótico-Antimicótico	Gibco	15240-062
Chip de vidro inferior	MicroFIT		24 x 24 x 1 mm, feito sob medida, ranhura retangular (6 x 12 mm, profundidade: 100 μ m)
Colágeno tipo I, cauda de rato	Corning	354236
Suporte de vidro personalizado	Han-Gug Mecatrônica	feito
Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)	Welgene	LM 001-11
salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)	Biowest	L0615-500	sem magnésio,
cálcio Soro bovino fetal (FBS)	Gibco	26140-179
FluoSpheres microesferas modificadas com amina	Invitrogen	F8764	0.2 µ m, fluorescente amarelo-esverdeado (505/515)
Fator de crescimento de hepatócitos (HGF)	Sigma-Aldrich	H1404-5UG	recombinante,
sistema de imagem de células vivas em estágio JuLI	NanoEnTek Em		estágio X-Y-Z automatizado e imagem de imagem fluorenviada Compatível com incubadora (37 ° C e 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)			tipo II
Sistema de plasma de oxigênio	Femto Science	CUTE-MPR
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
Rodamina B isotiocianato– dextrano	Sigma-Aldrich	R9379-100MG	70 kDa, usado para estimar a distribuição espaço-temporal de HGF no canal microfluídico
Agulha hipodérmica estéril 18 G	KOVAX		Apare a ponta da agulha e dobre-a 90 graus para conectar as portas de entrada/saída com linha de volume
Fita adesiva	3M/Scotch	810D	33 m x 19 mm
SU-8 moldes mestres	MicroFIT		4" de diâmetro,
sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato (Sulfo-SANPAH)	Thermo Scientific	22589	Conservar a -20°C. Conservar protegido da humidade e da luz.
Kit de Elastômero Sylgard 184	Dow Corning		PDMS
Bomba de seringa	Chemyx Inc.	modelo fusion 720	retirar fluido
Seringas	KOVAX		1, 3, 5, 10 ou 50 cc para uso reservatório de entrada ou bomba de seringa de saída
tetrametiletilenodiamina (TEMED)	Bio-Rad	1610800	Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos.
Lâmpada ultravioleta (UV)	UVP	LLC 95-0248-02	comprimento de onda de 365 nm

430165sob medida Solução humano