Måling af virkningerne af bakterier og kemikalier på tarm permeabilitet af Caenorhabditis elegans
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man måler tarm permeabilitet af Caenorhabditis elegans. Denne metode er nyttigt for grundlæggende biologisk forskning på tarm sundhed relateret til samspillet mellem tarm bakterier og deres vært og til screening for at identificere probiotiske og kemiske agenser til at helbrede utætte tarm syndrom og inflammatoriske tarmsygdomme.
Abstract
I levende organismer, intestinal hyperpermeabilitet er et alvorligt symptom, der fører til mange inflammatoriske tarmsygdomme (IBDs). Caenorhabditis elegans er en nonmammalian dyremodel, der er almindeligt anvendt som en analyse system på grund af sin korte levetid, gennemsigtighed, omkostningseffektivitet, og mangel på dyreetiske spørgsmål. I denne undersøgelse, en metode blev udviklet til at undersøge virkningerne af forskellige bakterier og 3, 3 ‘-diindolylmethane (DIM) på tarm permeabilitet af C. elegans med et højt gennemløb billedanalyse system. Ormene blev inficeret med forskellige tarm bakterier eller cobehandlet med DIM for 48 h og fodret med fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran natten over. Derefter blev intestinal permeabilitet undersøgt ved at sammenligne fluorescensbilleder og fluorescens intensiteten inde i orme organerne. Denne metode kan også have potentiale til at identificere probiotiske og patogene tarm bakterier, der påvirker tarm permeabilitet i dyremodellen og er effektiv til at undersøge virkningerne af skadelige eller sundhedsfremmende kemikalier på intestinal permeabilitet og tarm sundhed. Men denne protokol har også nogle betydelige begrænsninger på det genetiske niveau, især for at bestemme, hvilke gener der er ændret til at kontrollere sygdom, fordi denne metode er for det meste anvendes til fænotypiske bestemmelse. Desuden er denne metode begrænset til at bestemme præcis, hvilke sygdomsfremkaldende substrater forårsager betændelse eller øge permeabilitet af orme tarme under infektion. Derfor er yderligere dybtgående undersøgelser, herunder undersøgelse af den molekylære genetiske mekanisme ved hjælp af mutant bakterier og nematoder samt kemisk komponent analyse af bakterier, forpligtet til fuldt ud at evaluere funktionen af bakterier og kemikalier til bestemmelse af tarm permeabilitet.
Introduction
Intestinal permeabilitet betragtes som en af de vigtigste barrierer i forbindelse med den intestinale mikrobiota og slimhinde immunitet og vil sandsynligvis blive påvirket af flere faktorer, såsom Gut mikrobiota modifikationer, epitelial svækkelse, eller slim Layer ændringer1. Nylige papirer har rapporteret effektive protokoller til at måle tarm permeabilitet af dyrkede humane tarmceller ved at analysere fluorescens flux satser på tværs af tarm celle lag2, men færre forskningspapirer præsentere en passende procedure til måling af tarm permeabilitet i nematodes, især i C. elegans, ved hjælp af FITC-dextran farvning.
Der er to repræsentative protokoller til måling af tarm permeabilitet i C. elegans ved hjælp af Nile Red3 og erioglaucin dinatrium (eller Smurf assay)4,5. I denne protokol brugte vi FITC-dextran (gennemsnitlig molekylvægt 10.000), som har en meget højere molekylvægt end Nilen rød (MW = 318,37) og erioglaucindinatrium (MW = 792,85). FITC-dextran er mere ens end Nilen rød eller erioglaucin dinatrium farvestoffer til faktiske makromolekylære næringsstoffer såsom kulhydrater, som absorberes gennem tarm laget. Den intestinale permeabilitet af C. elegans fodret med erioglaucindinatrium (blåt Smurf farvestof) kan let evalueres uden Fluorescens mikroskopi. I Smurf-analysen er kvantitativ analyse af intestinal permeabilitet imidlertid vanskelig på grund af manglende standardisering og bør evalueres manuelt4,5. I tilfælde af Nilen rød analyse, også Nile Red pletter lipid dråber i celler, som kan forstyrre den nøjagtige bestemmelse af tarm permeabilitet i C. elegans6. De nuværende protokoller muliggør en hurtig og præcis kvantitativ analyse af tarm permeabilitet i C. elegans behandlet med forskellige tarm bakterier og kemikalier, samtidig med at uspecifik lipid farvning undgås.
C. elegans er en typisk model i biologiske felter på grund af sin overkommelige pris, nem manipulation, begrænset dyreetiske spørgsmål, og kort levetid, som er gavnlig for hurtige eksperimenter7. Især, efter at hele c. elegans genom blev offentliggjort, næsten 40% af gener i C. elegans genom blev fundet at være orthologous til gener, der forårsager sygdomme hos mennesker8. Desuden giver det gennemsigtige organ observation inde i organismen, hvilket er fordelagtigt for at forske i cellulære hændelser og for fluorescens applikationer i cellebiologi, for eksempel stamcelle farvning med DAPI eller immunhistochemistry9. C. elegans bruges ofte som forsøgsdyr til at studere interaktionen mellem Gut mikrobiota og værten; Desuden, C. elegaNS bruges til at screene sundhedsfremmende probiotiske bakterier10,11,12 samt kosten kemikalier fremme tarm sundhed13,14.
Pseudomonas aeruginosa og Enterococcus fæalis er velkendte tarm bakterier, der påvirker mave-tarmsystemet negativt, især de koloniske epiteliale celler i tarmkanalen15,16. Derfor er måling af tarm permeabilitet udløst af disse bakterier er nødvendig for screening og udvikling af nye lægemidler, der kan genvinde og reducere skaderne forårsaget af bakteriel inflammation og infektion. I denne protokol, vi testede virkningerne af disse tarm bakterier på tarm permeabilitet af C. elegans.
Vi rapporterer også en optimeret protokol til afprøvning af kemikalier på tarm permeabilitet af C. elegans. Til dette formål brugte vi 3, 3 ‘-diindolylmethane (Dim) som en model kemikalie, fordi Dim er en Bioaktiv metabolit sammensatte afledt af indol-3-carbinol, som er til stede i Brassica fødevarer planter, og er blevet rapporteret at have terapeutiske virkninger på IBD i mus17,18. Desuden har vi for nylig opdaget, at DIM forbedrer tarm permeabilitet dysfunktion i både dyrkede humane tarmceller samt model fyrretræsnematoden C. elegans19.
I denne undersøgelse, vi brugte tre forskellige eksperimentelle betingelser. For det første målte vi virkningerne af de forskellige bakterier, P. aeruginosa og E. fæalis, på intestinal permeabilitet (figur 1). For det andet målte vi virkningerne af levende og varme inaktiverede P. aeruginosa på intestinal permeabilitet (figur 2). For det tredje målte vi virkningerne af DIM (et model kemikalie) på tarm permeabiliteten af C. elegans fodret med P. aeruginosa (figur 3).
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle optimerede protokoller, der måler intestinal permeabilitet af C. elegans, som er ændret ved behandling med forskellige tarm bakterier samt med kemikalier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved at udnytte denne nye metode til bestemmelse af tarm permeabilitet i C. elegans, som kombinerer automatiseret Fluorescens mikroskopi og kvantitativ billedanalyse, kan forskellene forårsaget af intestinale mikroorganismer eller kemikalier bestemmes in vivo, specifikt i C. elegans tarmen. Denne protokol er nyttig for tarm permeabilitet undersøgelser og gælder for mange opgaver, såsom reaktive ilt arter (ROS) bestemmelse under stress betingelser og morfologiske undersøgelser, på grund af sin bekve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af en Korea Institute of Science and Technology murene Research Grant (2e29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
Referências
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3′-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3′-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3′-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3′-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
