Denne metoden beskriver bruken av R26R-konfetti (konfetti) musemodell for å studere mineralisert vev, som dekker alle trinn fra avl strategien til bildet oppnåelser. Inkludert er en generell protokoll som kan brukes på alle myke vev og en modifisert protokoll som kan brukes på mineralisert vev.
Merking en individuell celle i kroppen til å overvåke hvilke celletyper det kan gi opphav til og spore sin migrasjon gjennom organismen eller bestemme levetid kan være en effektiv måte å avdekke mekanismer for vev utvikling og vedlikehold. En av de viktigste verktøyene som er tilgjengelige for å overvåke celler in vivo er konfetti musemodell. Den konfetti modellen kan brukes til genetisk Label individuelle celler i levende mus med ulike fluorescerende proteiner i en celle type-spesifikk måte og overvåke deres skjebne, samt skjebnen til deres avkom over tid, i en prosess som kalles klonal genetisk tracing eller klonal avstamning tracing. Denne modellen ble generert nesten et ti år siden og har bidratt til en bedre forståelse av mange biologiske prosesser, særlig knyttet til stilk cellen biologi, utvikling, og fornyelse av voksen vev. Imidlertid, bevarer det fluorescerende signal til image innsamling av og samtidig fanger av forskjellige fluorescerende signaler er teknisk utfordrende, spesielt for mineralisert tissue. Denne publikasjonen beskriver en trinnvis protokoll for bruk av konfetti-modellen til å analysere vekst plate brusk som kan brukes på alle mineralisert eller nonmineralized vev.
Forbedrede metoder for å overvåke celle atferden er ønskelig å øke den eksperimentelle effektiviteten ved bruk av dyremodeller. Ettall av de fleste opplysende tilnærmelser å dataskjerm cellen opptreden inne Vivo er klonal avstamning tracing med flerfarget journalist musen belastninger1, inkluderer det vidt anvendt R26R-konfetti (konfetti) musen2. Ved genetisk merking individuelle celler med fluorescerende proteiner og følge disse cellene over tid, forskere i mange felt har brukt konfetti musen til å avdekke innsikt i en rekke ulike biologiske systemer.
Den konfetti musen er en loxP-basert reporter system der grobunn avhengig DNA rekombinasjon forårsaker den permanente uttrykk for en av flere mulige fluorescerende proteiner i et Stokastisk måte2. Den R26R-konfetti allel inkluderer overalt uttrykt CAGG arrangøren, som ligger umiddelbart oppstrøms av en loxP-flankert neoR-kassett2, hvis polyadenylation sekvensen opphører transkripsjon3, etterfulgt av Brainbow 2,1 konstruere4. Derfor, grobunn-mediert rekombinasjon samtidig avgifter neoR-kassett og fører til produksjon av visse fluorescerende proteiner avhengig av hvilke deler av Brainbow 2,1 konstruere er excised. Denne funksjonen gjør konfetti musen svært tilpasningsdyktig fordi den kan brukes til å målrette noen cellulære befolkningen i en mus som en bestemt grobunn er tilgjengelig. Krysset av en vev-spesifikk grobunn med R26R-konfetti belastningen gir spesifisitet av merking. Imidlertid bør grobunn også være induserbart (f. eks CreERT eller CreERT2, som krever Tamoxifen bindende å tillate dem å gå inn i kjernen og indusere DNA rekombinasjon5) slik at merking kan oppnås på angitte tidspunkt poeng. Således kan en cellulær befolkning merkes ved å injisere den resulterende CreERT-positive/konfetti-positive avkom med Tamoxifen på ønsket tidspunkt og spores til en viss alder, når vevet av interesse kan samles for analyse. Etter vevs behandling, kan fluorescensmerkete merket celler bli direkte visualisere av konfokalmikroskopi mikroskopi slik at avkom av hver først-merket celle kan skilles fra avkom generert av en annen merket celle basert på deres spesifikke fluorescerende og dermed tillate celleklonalitet å bli vurdert (dvs. klonal genetisk tracing).
På grunn av fleksibiliteten i konfetti modellen, har det vært brukt til å studere utvikling og vedlikehold av mange forskjellige vev i helse og sykdom2,6,7,8,9, 10,11. En vanlig måte å bruke modellen er å merke en viss befolkning av celler og bestemme hvilke vev de (og/eller deres avkom) har bidratt til. En slik oppdagelse ved hjelp av denne tilnærmingen var at den voksne tannen består av celler med en gliacellene opprinnelse6. En annen anvendelse av modellen er å studere stilk cellen homeostase. For eksempel avslørte konfetti modellen at Stamcelle nisjer i tarm Krypter gradvis blir monoklonale fordi noen Stamcelle kloner er dominerende under konkurransen mellom stamceller2. Modellen kan også brukes til å vurdere celle spredning, noe som er spesielt nyttig for å studere langsomt dele celler. For eksempel ble klonal formasjon i ledd brusk12 vurdert, og de kortsiktige virkningene av et pinnsvin som var motstander av vekst plate chondrocytes i fem uker gamle mus, ble studert13.
Til tross for den relative enkelhet av konfetti modellen, kan fluorescerende signalet være teknisk utfordrende å bevare til bilde samlingen, spesielt når analysere mineralisert vev. Her beskriver protokollen en optimalisert modell for å bruke konfetti musen med postnatal bein (opptil 6 måneders alder), slik at fluorescerende proteiner å være direkte visualisere av konfokalmikroskopi mikroskopi uten behov for immunodetection. Denne forenklede protokollen kan brukes på nonmineralized vev. Videre er inkludert en beskrivelse av hvordan du lagrer prøvene for å bevare fluorescerende signal i en lengre periode på minst 3 år. En skisse av protokollen er presentert i figur 1.
Den konfetti modellen ble brukt mye for å studere mineralisert brusk vev12,13,14 og for å beskrive den optimaliserte protokollen. Konfetti mus2 med ett eksemplar eller to eksemplarer av R26R-konfetti allel kan brukes til avl og eksperimenter. Rekombinasjon i mus med en allel av Brainbow 2,1 konstruere vil gi fire mulige etiketter: rødt fluorescerende protein (RFP, cytoplasmatiske), gult fluorescerende protein (YFP, cytoplasmatiske), cyan fluorescerende protein (CFP, membran-lokaliserte), og grønn fluorescerende protein (GFP, Nucleus-lokaliserte), mens rekombinasjon i homozygote konfetti mus (dvs. inneholder to eksemplarer av Brainbow 2,1 konstruere) vil gi 10 mulige farge utganger (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + CFP, RFP + GFP, YFP + YFP, YFP + CFP, YFP + GFP, CFP + CFP, CFP + GFP, GFP + GFP). Men fordi DNA forbruker-og inversjon hendelser oppstår i en Stokastisk måte, rekombinasjon å produsere GFP oppstår i bare en liten brøkdel av celler, som tidligere rapportert2, og tilsynelatende avviker med celle-type eller grobunn linje brukt2, 12,13. Derfor, gitt den lave forekomsten av rekombinasjon hendelser som fører til GFP-uttrykket, er seks farge utganger de vanligste i homozygote konfetti-mus.
En viktig faktor når du planlegger eksperimenter med konfetti musen er å finne en passende grobunn. Først, siden konfetti allel har flere loxP nettsteder, en rekombinasjon hendelse utelukker ikke en andre4. Dette betyr at hvis en celle er merket og deler for å produsere en klone av en farge, en annen rekombinasjon hendelse i en av sine datter celler ville generere en annen farge, og dermed maskering den sanne klonal ekspansjon. Således, noninducible grobunn stammer, der enzymet er alltid aktiv hvis tilsvarende promoter er aktiv, er ikke tilrådelig. For det andre, i noen stammer uttrykket av grobunn recombinase ofte kommer på bekostning av en endogene protein, og dermed skape en fenotype av sine egne (f. eks, for Prg4-GFPCreERT2 knock-in musen belastning der mus havn to grobunn alleler15), så en enkelt kopi av grobunn allel er ønskelig. I alle de beskrevne forsøkene, en enkelt kopi av Col2CreERT16 ble båret av enten den mannlige eller kvinnelige forelder å generere Col2CreERT: konfetti mus, som beskrevet13. Deretter er det spesifisitet av grobunn linje til cellen type interesse en viktig faktor. For eksempel, Col2CreERT er chondrocyte-spesifikk, bortsett fra etiketter adskillige adskilt befolkninger av chondrocytes inne tidlig postnatal brusk17. Til slutt, aktiviteten av ulike grobunn stammer kan endre betraktelig med dyre alder, som den endogene aktiviteten til arrangøren benyttet for grobunn uttrykk endringer, selv i celler av samme type (f. eks Prg4-GFPCreERT2, som kan kreve en økende antall Tamoxifen doser for å merke overfladiske sone celler som mus alder15).
Antall merket celler vil bli reflektert av mengden av Tamoxifen gitt, så det er ikke alltid ønskelig å gi maksimal dose fordi skille kloner fra hverandre kan være vanskelig. Fordi grobunn uttrykket vil variere under regulering av ulike arrangører så vel som med alderen, den Tamoxifen dosering må justeres for å optimalisere merking. Det er viktig å merke seg at cellene ikke er umiddelbart fluorescerende ved utløser rekombinasjon fordi tiden er nødvendig for rekombinasjon å skje og de resulterende fluorescerende proteiner å akkumulere tilstrekkelig for Imaging. Et bredt spekter av timer (mellom 24-72 h) er nødvendig, noe som synes å være påvirket av grobunn linje, celle-type, og dyre alder. Siden Tamoxifen kan være biologisk aktive lenge etter administrering18 det er alltid tilrådelig å grundig sjekke rekombinasjon effektivitet i hver modell.
Under konfokalmikroskopi mikroskopi trinn, eksitasjon av konfetti fluorescerende proteiner krever inntrengning av vevet med laser lys. Fordi ulike vev har forskjellige egenskaper, laser lys kan ikke trenge 160 μm tykke deler av alle vev. Imidlertid kan slike tykke seksjoner brukes for vekst plate brusk, som brukes i figur 2, Figur 3. Merk at hvert mikroskop er forskjellig, og det er usannsynlig at de beskrevne innstillingene (supplerende fil 1) vil fungere perfekt uten mindre justeringer. En av de store utfordringene er å skille de ulike fluorescerende proteiner for å sikre at det ikke er forurensning fra en kanal til en annen. For eksempel signalet i YFP kanal forårsaket av fluorescens kommer fra GFP overlappinger mellom YFP og RFP kanaler. YFP og CFP-kanaler må også sjekkes nøye. Dette kan gjøres på flere måter. For det første kan utslippsområdet til lysbølgelengder som er registrert for hvert fluorescerende protein begrenses. For det andre kan justering av laser effekt i kombinasjon med den digitale forsterkningen optimalisere signalet. I denne studien var disse trinnene tilstrekkelige, men de er avhengige av et sterkt fluorescerende signal. Dette betyr at i teorien, ineffektiv vevs behandling kan redusere aktiviteten av fluorescerende proteiner, eller en svak laser lyskilde kan svekke kanal separasjon.
En av fordelene med konfetti musen er at den kan kombineres med et stort antall genetisk muterte stammer som er tilgjengelige slik at virkningen av spesifikke gener på klonal dynamikk kan bli studert10,11,12 ,13,14,19,20, riktignok med noen begrensninger. For eksempel kan rekombinasjon av konfetti alleler og genet av interesse ikke skilles ved bruk av grobunn loxP-baserte mutanter kombinert med klonal avstamning tracing. Likevel kan slike samtidig rekombinasjon hendelser være effektive10,14,20. For eksempel ble denne muligheten brukt til å utforske det økte celle tallet i hvile sonen til mus etter postnatal chondrocyte-spesifikke ablasjon av TSC1 i vekst platen21 og avslørte det klonal forholdet mellom disse cellene over tid 13. i tillegg kan den vevs spesifikke klonal analysen ved hjelp av konfetti mus brukes med ikke-grobunn loxP-baserte mutant mus11, og det er også mulig å kombinere disse tilnærmingene med farmakologisk8,9 ,13 og/eller kirurgiske modeller8 for å visualisere klonal reaksjoner på andre funksjonelle forstyrrelser. Ytterligere muligheter oppstår når kombinere konfetti merket seksjoner med immunodetection av endogene proteiner av immunofluorescence. Slik analyse tillater identifisering av spores celler og deres colocalization med en kjent markør. Med fiksering metoden beskrevet her, er det mulig å gjennomføre immunofluorescence og fortsatt visualisere fluorescens fra konfetti fluorescerende proteiner12,13. Men i avisene nevnt, antigen henting var ikke nødvendig. Harde antigen gjenfinning metoder, slik som koking i citrate buffer, fører til et fullstendig tap av konfetti fluorescens. Selv om konfetti fluorescerende proteiner kan oppdages ved å bruke antistoffer22, kan det oppstå tap av klonal identitet.
Oppsummert, ved hjelp av konfetti modellen for å merke celler in vivo er et informativt verktøy for å analysere skjebnen til disse cellene over tid. Den beskrevne metoden gir en rask og effektiv måte å direkte visualisere fluorescerende protein uttrykk i mineralisert vev.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Evgeny Ivashkin for metodisk råd. Dette arbeidet ble støttet finansielt av det svenske Forskningsrådet (S.s. C), den russiske vitenskapelige stiftelse (Grant #19-15-00241 til ASC), Karolinska Institute (A.S.C.), StratRegen KI og stiftelsen konung Gustaf V:s 80-årsfond (A.S.C.), stiftelsen Frimurare Barnhuset og Sallskapet Barnavard (P.T.N.), kinesisk stipend Council (B.Z.). Konfokalmikroskopi mikroskop ble finansiert av Knut og Alice Wallenberg Foundation.
2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Corn oil | Sigma | C8267 | |
Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
OCT | Sakura | 102094-104 | |
Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
PBS | Gibco | 14200075 | |
Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |