Pancreasvæv-afledte ekstracellulære matrix Bioink til udskrivning 3D celle-lastet pancreas væv konstruktioner
Summary
Decellularized ekstracellulær matrix (dECM) kan give passende mikromiljø signaler til at samle de iboende funktioner af målvæv i en konstrueret konstruktion. Denne artikel belyser protokollerne til decellularization af pancreas væv, evaluering af bugspytkirtlen væv-afledte decm bioink, og generation af 3D pancreas væv konstruktioner ved hjælp af en bioprinting teknik.
Abstract
Transplantation af bugspytkirtlen Holme er en lovende behandling for patienter, der lider af type 1 diabetes ledsaget af hypoglykæmi og sekundære komplikationer. Men, ø transplantation har stadig flere begrænsninger såsom den lave levedygtighed af transplanterede Holme på grund af dårlig ø engraftment og fjendtlige miljøer. Desuden har de insulin producerende celler, der er differentieret fra humane pluripotente stamceller, begrænset evne til at udskilte tilstrækkelige hormoner, som kan regulere blodsukkerniveauet; Derfor er det stærkt påkrævet at forbedre modning ved dyrkning af celler med passende mikromiljø signaler. I denne artikel, vi belyse protokoller for at forberede en bugspytkirtel væv-afledte decellularized ekstracellulære matrix (pdECM) bioink at give en gavnlig mikromiljø, der kan øge glukose følsomhed af pancreas Holme, efterfulgt af at beskrive processerne til generering 3D pancreas væv konstruktioner ved hjælp af en microextrusion-baserede bioprinting teknik.
Introduction
For nylig, bugspytkirtel ø transplantation er blevet betragtet som en lovende behandling for patienter med type 1 diabetes. Den relative sikkerhed og minimal invasivitet af proceduren er store fordele ved denne behandling1. Men, det har flere begrænsninger såsom den lave succesrate af isolerende Holme og bivirkninger af immunosuppressive lægemidler. Desuden falder antallet af indpodede Holme støt efter transplantation på grund af det fjendtlige miljø2. Forskellige biokompatible materialer såsom alginat, kollagen, poly (mælke-Co-glycolsyre) (PLGA) eller polyethylenglycol (PEG) er blevet anvendt til pancreas-ø-transplantation for at overvinde disse vanskeligheder.
3D celle trykning teknologi er ved at dukke op i vævsteknik på grund af sit store potentiale og høj ydeevne. Det er overflødigt at sige, bioinks er kendt som vigtige komponenter til at give et egnet mikromiljø og gør det muligt at forbedre cellulære processer i trykte væv konstruktioner. Et betydeligt antal forskydningsfortyndende silicagelrogeler såsom fibrin, alginat og kollagen er almindeligt anvendt som bioinks. Men disse materialer viser en mangel på strukturel, kemisk, biologisk, og mekanisk kompleksitet i forhold til den ekstracellulære matrix (ECM) i native tissue3. Mikromiljømæssige signaler såsom samspillet mellem Holme og ECM er vigtige signaler for at forbedre funktionen af Holme. Decellularized ECM (decm) kan genskabe den vævsspecifikke sammensætning af forskellige ECM komponenter herunder kollagen, glycosaminoglycaner (gags), og glykoproteiner. For eksempel, primære Holme, der bevarer deres perifere ECMs (f. eks. type I, III, IV, V og VI kollagen, Laminin, og fibronectin) udviser lav apoptose og bedre insulinfølsomhed, hvilket indikerer, at vævsspecifikke celle-matrix interaktioner er vigtige for at øge deres evne til at fungere på samme måde som oprindelige væv4.
I dette dokument vi belyse protokoller til fremstilling af pancreas væv-afledte decellularized ekstracellulær matrix (pdecm) bioink at give gavnlige mikromiljømæssige stikord til at øge aktiviteten og funktioner af bugspytkirtlen Holme, efterfulgt af processerne til generering 3D pancreas væv konstruktioner ved hjælp af en microekstrudering-baseret bioprinting teknik (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskrev udviklingen af pdECM bioinks og fabrikation af 3D pancreas væv konstruktioner ved hjælp af 3D celle trykning teknikker. For at rekapitulere mikromiljøet af målvævet i 3D manipuleret væv konstruere, valget af bioink er kritisk. I en tidligere undersøgelse, vi valideret, at vævs-specifikke dECM bioinks er gavnlige for at fremme stamcelle differentiering og spredning10. Sammenlignet med syntetiske polymerer, dECM kan tjene som en celle-gunstige miljø på grund af den v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af bio & Medical Technology Development program af National Research Foundation (NRF) finansieret af den koreanske regering (MSIT) (2017M3A9C6032067) og “ICT consilience Creative program” (IITP-2019-2011-1-00783) under tilsyn af IITP (Institut for informations & kommunikationsteknologi, planlægning & evaluering).
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
Referências
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?. Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
