Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Islmn:GFP Ratos Transgênicos

Ryosuke Fujiki; Joun  Y. Lee; Julie  A. Jurgens; Mary  C. Whitman; Elizabeth C. Engle

doi:10.3791/60440

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Artigo de método

Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Isl^mn:GFP Ratos Transgênicos

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DOI:

10.3791/60440

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12 de novembro de 2019

Ryosuke Fujiki¹^,²^,³^,⁴^,⁹ , Joun Y. Lee¹^,²^,¹⁰ , Julie A. Jurgens¹^,²^,³^,⁷ , Mary C. Whitman²^,⁵^,⁶ , Elizabeth C. Engle¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸

¹Department of Neurology, Boston Children's Hospital, ²FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, ³Department of Neurology, Harvard Medical School, ⁴Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, ⁵Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, ⁶Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, ⁷Broad Institute of M.I.T. and Harvard, ⁸Howard Hughes Medical Institute, ⁹Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, ¹⁰Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este trabalho apresenta um protocolo para produzir culturas celulares homogêneas de neurônios motores oculomotores primários, trochlear e espinhais. Essas culturas podem ser usadas para análises comparativas das características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores oculares e espinhais.

Resumo

Neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) apresentam notável resistência a doenças degenerativas do neurônio motor, como esclerose lateral amiotrófica (ELA) quando comparados aos neurônios motores espinhais (SMNs). A capacidade de isolar e cultura cn3s rato primário, CN4s, e SMNs proporcionaria uma abordagem para estudar os mecanismos subjacentes a esta vulnerabilidade seletiva. Até o momento, a maioria dos protocolos utiliza culturas géterogêneas celulares, que podem confundir a interpretação dos resultados experimentais. Para minimizar os problemas associados às populações de células mistas, as culturas puras são indispensáveis. Aqui, o primeiro protocolo descreve em detalhes como purificar e cultivar eficientemente CN3s/CN4s ao lado de contrapartes de SMNs dos mesmos embriões usando o dia embrionário 11.5 (E11.5) Isl^MN:GFP embriões transgênicos do rato. O protocolo fornece detalhes sobre a dissecção e dissociação de tecidos, isolamento celular baseado em FACS e cultivo in vitro de células dos núcleos CN3/CN4 e SMN. Este protocolo adiciona um novo sistema de cultura CN3/CN4 in vitro aos protocolos existentes e, simultaneamente, fornece uma cultura SMN pura e de espécies combinadas para comparação. Análises com foco nas características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores são viáveis neste sistema de cultura. Este protocolo permitirá a pesquisa nos mecanismos que definem o desenvolvimento do neurônio motor, a vulnerabilidade seletiva, e a doença.

Introdução

A cultura dos neurônios motores primários é uma ferramenta poderosa que permite o estudo do desenvolvimento neuronal, função e susceptibilidade a estressores exógenos. As culturas dos neurônios motores são particularmente úteis para o estudo de doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA)^1,^2,cujos mecanismos de doença são incompletamente compreendidos. Curiosamente, apesar da morte celular significativa de neurônios motores espinhais (SMNs) em pacientes com ELA e camundongos modelo ALS, morte celular em neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) são relativamente escas....