Химически-индуцированной модели карциногенеза кожи Использование диметилбенцзазаии и 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Ацетат (DMBA-TPA)
Summary
Двухступенчатый кожный канцерогенез индуцируется двумя местно прикладными химическими веществами. Мутаген 7,12-диметилбенцзазазазас) вызывает мутации в эпидермальных клетках и непрерывное применение стимулятора общего роста 12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-ацетат ускоряет формирование папилломы кожи.
Abstract
Рак является одним из самых разрушительных заболеваний человека. Экспериментальные модели рака важны для получения информации о сложном интерплене различных типов клеток и генов в продвижении прогрессирования опухоли и предоставить платформу для тестирования эффективности различных терапевтических подходов. Одной из наиболее часто используемых экспериментальных моделей воспалительного рака является двухступенчатая модель канцерогенеза DMBA-TPA. Формирование опухоли индуцируется в этой модели путем местного применения двух различных химических веществ, 7,12-диметилбенза (DMBA) и 12-O-Tetradecanoyl форбол-13-ацетат (TPA), которые вместе вызывают образование папилломы в коже. В качестве основного результата является формирование папилломы в коже, модель является идеальным, надежным и воспроизводимым способом решения как инициации опухоли (без опухолевого выживания) и прогрессирования опухоли (количество и размер видимых опухолей). Эффекты лечения DMBA-TPA передаются через воспалительный механизм, что делает эту модель особенно подходящей для изучения роли иммунной системы в формировании опухоли. Тем не менее, эта модель ограничивается кожи и других поверхностей, где химические вещества могут быть применены на. Подробный протокол предоставляется в этой статье, чтобы успешно использовать модель.
Introduction
Рак является одной из ведущих причин смерти в мире. Поэтому существует спрос на разработку надежных экспериментальных моделей заболеваний, чтобы лучше понять болезнь, а также изучить потенциальные терапевтические подходы. Один из наиболее часто используемых экспериментальных моделей in vivo для изучения развития рака кожи является химически индуцированной двухступенчатой модели канцерогенеза кожи1,2. Модель предоставляет инструмент для изучения инициации опухоли, поощрения и прогрессирования в дополнение к конкретным событиям, таким как инфильтрация иммунных клеток и ангиогенез.
Для использования двухступенчатой модели канцерогенеза кожи, задняя кожа мышей лечится двумя различными химическими веществами, которые вместе вызывают образование опухоли. Модель инициируется с низкой дозой мутагена, DMBA, а затем длительное воздействие опухолевого промотора, TPA3 (Рисунок 1). DMBA устраняет ДНК случайнымобразом,образуя ковалентные аддукты с ДНК эпидермальных клеток и первичных кератиноцитов стволовых клеток4,5,6,7. Некоторые из этих случайных мутаций происходят в протоонкогене, таких как Hras1 (мутации в Красе и Нрасе также обнаружены) и преобразование протоонкогенов в онкогены приводит к образованию опухоли при надлежащих стимулах. TPA, в свою очередь, является наиболее часто используемым средством роста опухоли. Его молекулярная цель – протеина киназа C (PKC)8. TPA также активирует Wnt / катенин сигнализации, что имеет решающее значение для формирования опухоли в модели9. Повторное и длительное воздействие рекламирующего агента приводит к усилению клеточной сигнализации, увеличению выработки факторов роста и локальной воспалительной реакции, которые проявляются из-за повышенного синтеза ДНК и проникновения воспалительных клеток в обработанную кожу.
Ключевые воспалительные посредники в модели DMBA-TPA были определены10. Интерлейкин-17А (IL-17A), как известно, особенно опухолевых в модели DMBA-TPA11,12. Он работает в синергии с интерлейкином 6 (IL-6) и участвует в макрофаге и нейтрофилов вербовки13,14. Кроме того, было показано, что CD4и Т-клетки и нейтрофилы опухолевые в модели DMBA-TPA. Наконец, макрофаги могут также способствовать опухолевому в модели15,16,17.
Во время этапа продвижения, пролиферация клеток мутировавших клеток усиливается и устойчивая гиперплазия эпидермиса поддерживается1. Это приводит к развитию папилломы в коже через 10-20 недель, после чего папилломы начинают преобразовываться в злокачественные опухоли, плоскоклеточные карциномы (СКК)2. Однако, менее 10% папиллом прогрессирует до злокачественных новообразований, хотя этот процент также зависит от генетического фона мышей2,18. На протяжении десятилетий не было известно, какой тип клеток были первоначально мутировали в опухолях, ведущих к злокачественности, хотя некоторые исследования сообщили четко различные особенности в злокачественных опухолей по сравнению с доброкачественными папилломы19,20. Тем не менее, недавние исследования значительно увеличили наше понимание клонального происхождения образования опухоли в модели DMBA-TPA21. 22. 23. Было продемонстрировано, что как костного мозга полученных эпителиальных клеток и волосяного фолликула стволовых клеток способствуют образованию опухоли22. Этап конкретных линий отслеживания исследований обнародовал, что доброкачественные папилломы моноклонального происхождения, но они вербуют новые эпителиальные популяции клеток21,23. Однако, только один из клонов клетки действует как водитель для канцерогенеза; он содержит мутацию Hras23. Прогрессирование к образованию карциномы связано с клональной развертки23.
Канцероген DMBA инициирует формирование папилломы и TPA способствует росту опухоли. Таким образом, инициация опухоли может быть изучена отдельно от продвижения, прервав эксперимент до периода лечения TPA. По мере того как прогрессирование тумора изучено еженедельно оно предлагает большую возможность для детального анализа роста тумора в течении изучения. Поскольку опухоли генерируются внешними химическими веществами, онкогенная мутация в зародышевой линии не нужна. Таким образом, изучение влияния генетического фона (например, нокаут/трансген против дикого типа) на опухолевый генез является простым2. В целом, модель рака кожи DMBA/TPA является особенно полезным подходом для изучения роли иммунной системы в прогрессировании опухоли, а также для оценки инициирования опухоли и продвижения шагов независимо или взаимозависимо.
Рисунок 1: DMBA-TPA-индуцированной кожи канцерогенез модели контура. Канцероген DMBA местно применяется для индуцирования мутаций ДНК в фазе инициации модели. Стимулирующий рост агент TPA вводится 2 раз в неделю для повышения пролиферации клеток на этапе продвижения, что приводит к развитию папиллом в коже. Звери приносятся в жертву после того, как папиллома ответ достигает плато, как правило, в течение нескольких недель 15-20, в зависимости от генетического фона мышей. Небольшая часть папиллом может далее развиваться в SCCs в течение 20-50 недель. Для изучения ранних событий на этапе посвящения и раннего продвижения могут быть собраны образцы (например, вскоре после второго применения TPA). Представленная фотография и гематоксилин и эозин окрашенных сечение папилломы на c57BL/6 мыши кожи после 19 недель лечения показаны. Шкала бар 0,1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Protocol
Representative Results
Discussion
DMBA-TPA-индуцированных рака кожи является одним из наиболее часто используемых моделей рака, поскольку он является высоко воспроизводимым и предоставляет информацию о прогрессии опухоли от начала до злокачественности. Ключевой показатель исхода, образование папилломы, легко и надежно ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Академией Финляндии (гранты 25013080481 и 25013142041 (I.J.), 286377 и 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), P’ivikki и Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Финский медицинский фонд (T.P.), Конкурентное государственное исследование Финансирование экспертной зоны ответственности университетской больницы Тампере (грант 9V049 и 9X044 (M.P.), 9X011 и 9V010 (T.J.)), Конкурентное государственное научно-исследовательское финансирование экспертной зоны ответственности лабораторий Fimlab (грант X51409 (I.J.)), Tays Фонд поддержки (I.J., M.P., T.J.), Фонд туберкулеза Тампере (I.J., M.P., T.J.), Финский культурный фонд (M.V.), Фонд Пауло (T.P.), Онкологическое общество Финляндии (M.P.) и Фонд Эмиля Аалтонена (T.P.).
Materials
| 1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
| 300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
| 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
| Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
| Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
| Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
| CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
| Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
| Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm – Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
| Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
| Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
| Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
| Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
| Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
| Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
| UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |
Referências
- DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
- Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
- Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
- Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
- Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
- Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
- Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
- Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
- Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
- Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
- Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Pesquisa do Câncer. 70 (24), 10112-10120 (2010).
- He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
- Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
- Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
- Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Pesquisa do Câncer. 68 (10), 3924-3930 (2008).
- Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
- Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Pesquisa do Câncer. 53 (20), 4803-4810 (1993).
- Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
- Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
- Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, 400-409 (2015).
- Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
- Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
- Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
- Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
- Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
- Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
- May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
- Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
- Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
- Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
- Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
- Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Pesquisa do Câncer. 39 (4), 1293-1297 (1979).
- Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Pesquisa do Câncer. 40, 4352-4355 (1980).
- Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
- Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
- Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
- Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
- Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
- Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
- Day, C. -. P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).
