Denne protokollen presenterer en integrert Raman spektroskopi-Mass massespektrometri (MS) plattform som er i stand til å oppnå enkelt celle oppløsning. Raman spektroskopi kan brukes til å studere cellulær respons på narkotika, mens MS kan brukes til målrettet og kvantitativ analyse av narkotika opptak og metabolisme.
Celler er kjent for å være iboende heterogen i sine svar på narkotika. Derfor er det viktig at single-Cell heterogenitet er beregnet for i narkotika funn studier. Dette kan oppnås ved nøyaktig å måle mengde mobilnettet interaksjoner mellom en celle og narkotika på enkelt cellenivå (dvs. narkotika opptak, metabolisme, og effekt). Dette papiret beskriver en enkelt celle Raman spektroskopi og masse massespektrometri (MS) plattform for å overvåke metabolske endringer av celler som svar på narkotika. Ved hjelp av denne plattformen, metabolske endringer i respons til stoffet kan måles ved Raman spektroskopi, mens stoffet og metabolitten kan kvantifisert ved hjelp av masse massespektrometri i samme celle. Resultatene tyder på at det er mulig å få tilgang til informasjon om narkotika opptak, metabolisme og respons på et enkelt cellenivå.
Celler reagerer forskjellig på endringer i deres mikromiljøet på enkelt cellenivå, et fenomen som kalles cellulær heterogenitet1. Til tross for dette er dagens funn studier basert på gjennomsnittlige målinger av celle populasjoner, som obfuscate informasjon om potensielle subpopulasjoner i tillegg til enkelt celle variasjoner2. Denne manglende informasjonen kan forklare hvorfor noen celler er mer utsatt for rusmidler, mens andre er motstandsdyktige. Interessant nok er mangelen på enkelt celleinformasjon om narkotika responsen en mulig årsak til svikt i fase II kliniske studier av narkotika3. Derfor, for å løse dette problemet, cellulære interaksjoner med stoffet (dvs. opptak, metabolisme, og respons) må måles på enkelt cellenivå.
For å oppnå dette, har vi designet et unikt system der levende enkeltceller er vist ved hjelp av etikett-fri Raman spektroskopi deretter videre karakterisert ved hjelp av masse massespektrometri4. Raman spektroskopi gir en molekylær fingeravtrykk av mobilnettet tilstand, et komplekst spektrum som følge av bidrag fra mange molekyler inne i cellen. Til tross for denne kompleksiteten, kan det betraktes som Raman fingeravtrykk reflekterer en hel cellestruktur og metabolisme5,6. Raman spektroskopi utmerker seg med å måle cellulære stater i en ikke-invasiv og relativt høy gjennomstrømmings måte, noe som gjør det nyttig for screening og vurdering av narkotika responsen på enkelt cellenivå.
I kontrast gir MS den nødvendige følsomheten og selektivitet for måling av legemiddel opptak på enkelt cellenivå. Siden MS er ødeleggende (prøven [cellen] er vanligvis forbrukes under analyse), integrere den med ikke-destruktiv, etikett-fri Raman spektroskopi kan gi en høy gjennomstrømning og sensitivt system. Denne kombinerte plattformen er i stand til å gi mer informasjon om narkotika opptak, metabolisme og effekter på enkelt cellenivå.
Dette manuskriptet kaster en protokoll som brukes til å studere mobil interaksjon med rusmidler på enkelt cellenivå ved hjelp av in vitro-kulturer ved hjelp av en integrert Raman-MS-plattform. For å gjøre dette, leverkreft celler (HepG2) og Tamoxifen brukes som en modell. HepG2 celler ble valgt fordi de tar opp Tamoxifen og forbrenne stoffet, og de er samtidig påvirket på grunn av sin hepatotoxic effekter. To delstater er brukt i dette manuskriptet: stoff-behandlede celler kontra ikke-behandlede celler (kontroll).
I dette manuskriptet ble det valgt en enkel sak der HepG2-celler ble eksponert (eller ikke) til Tamoxifen. Muligheten for en Raman spektroskopi og masse massespektrometri systemet er demonstrert for å overvåke virkningene av Tamoxifen på celler. Raman spektroskopi tillot identifisering av potensielle biomarkører som reflekterte en generell respons av enkeltceller til legemiddel eksponering. Noen heterogenitet mellom enkeltceller ble observert, noe som tyder på at noen celler ikke reagerte på narkotika eksponering. På den annen side, LSC-MS var i stand til å utføre en målrettet analyse av stoffet og metabolitten på enkelt cellenivå, der en høy grad av heterogenitet ble observert i stoffet og dets metabolitten overflod. Dette heterogenitet bidrar til å forklare hvorfor noen celler påvirkes av stoffet, mens andre er tilsynelatende ikke, til tross for cellene som stammer fra en angivelig uniform befolkning12.
Blant spesielle aspekter av denne teknikken som krever oppmerksomhet, er det viktig å evaluere kvaliteten på mikroskop oppsettet og signal behandlingen for å sikre reproduserbarhet av dataene. Hvis forbehandling av Spectra gjøres forsiktig, bør signalet variasjoner maksimeres på lokalt maksimum for hver topp. I motsetning bør grunnlinjen og kanten av Spectra overlappe mellom de testede celle forholdene. Et annet viktig aspekt er multivariabel modell som brukes til å undersøke forskjellene mellom behandlingene. Man må nøye evaluere modeller og modell parametre for å sikre en presis og nøyaktig analyse. En fordel med PLS-modellen, i motsetning til nevrale nettverk, er at det gir tilgang til vekter knyttet til hver bølgelengde (Raman Skift) som best skiller forholdene testet av modellen.
Til tross for Raman spektroskopi vellykket diskriminerende stoffet respons, bør det understrekes at denne teknikken er begrenset i bruk for å gi biologisk tolkning. Dette skyldes i hovedsak kompleksiteten til Spectral signalet, som omfatter en blanding av tusenvis av molekyler. Det er derfor nødvendig med ytterligere undersøkelser for å evaluere systematiske variasjoner mellom Raman Spectral intensitet og variasjoner i konsentrasjonen av legemidlet. Også, lignende studier av andre cellelinjer er nødvendig for å evaluere generalisering av Spectral biomarkører forbundet med Tamoxifen.
Videre kan det være av interesse å utføre levende vev målinger for å vurdere farmakodynamikk og studere hvordan narkotika trenge inn og flyte i hver celle. Videre bør det bemerkes at prøvetaking trinnet i LSC-MS er svært avhengig av dyktighet av operatøren. Parametre som romlig oppløsning, celle posisjon inne i kapillær etter prøvetaking, og gjennomstrømning styrke er helt operatøravhengig, som begrenser stor skala adopsjon av LSC-MS. Selv om automatiserte sampling systemer kan lindre dette problemet. Videre, mens LSC-MS utmerker seg på prøvetaking tilhenger eller flytende celler i deres opprinnelige stater, det utfører mer dårlig i prøvetaking celler innebygd i vev seksjoner. Dette skyldes prøvetaking kapillær spissen tendens til å bryte hvis prøven tettheten er høy. Derfor kan en annen tilnærming som single-sonde være mer egnet i slike tilfeller14,15.
Siden cellene som brukes her er samplet i omgivelsesforhold med minimal prøve forberedelser, kan LSC-MS enkelt integreres med andre teknologier, som vist ved sin integrasjon med Raman i denne protokollen. En annen lignende integrasjon med 3D-holography har gjort det mulig å oppnå absolutt kvantifisering av cellulære metabolitter på subcellulære nivå16. I tillegg har integrasjon med Flow flowcytometri tillatt for avdekke metabolske biomarkører i enkelt sirkulerende tumorceller av neuroblastom kreftpasienter17,18.
I fremtiden, på grunn av nylige økende interesse i å kombinere datasett fra Imaging modaliteter19, kan det også være av interesse å studere systematiske variasjoner mellom Raman signaler og masse massespektrometri resultater (så vel som andre omics metoder) ved hjelp av integrerende beregningsorientert tilnærminger. Interessant, har vi allerede funnet flere svake, men betydelige lineære sammenhenger mellom intensiteten av Raman topper identifisert av VIP score og overflod av Tamoxifen eller metabolitten på single-cellenivå som identifiseres av MS4. Disse dataene kan tyde på et metabolsk forhold mellom MS-profiler og Raman Spectra og muligheten til å forutsi disse verdiene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Toshio Yanagida for hans støtte og RIKEN interne samarbeidende midler tilskrives Dr. Arno Germond.
0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
On-stage incubator | ibidi | ||
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |