Detta protokoll presenterar en integrerad Raman spektroskopi-masspektrometri (MS) plattform som kan uppnå encells-upplösning. Raman spektroskopi kan användas för att studera cellulära svar på läkemedel, medan MS kan användas för riktad och kvantitativ analys av läkemedelsupptag och metabolism.
Celler är kända för att vara till sin natur heterogena i sina svar på droger. Det är därför viktigt att en heterogenitet för enskilda celler redovisas i studier av läkemedels upptäckt. Detta kan uppnås genom att noggrant mäta den uppsjö av cellulära interaktioner mellan en cell och läkemedel på encelliga nivå (dvs, drog upptag, metabolism, och effekt). Denna uppsats beskriver en encellig Raman spektroskopi och masspektrometri (MS) plattform för att övervaka metaboliska förändringar av celler som svar på läkemedel. Med hjälp av denna plattform, metaboliska förändringar som svar på drogen kan mätas med Raman spektroskopi, medan drogen och dess metabolit kan kvantifieras med masspektrometri i samma cell. Resultaten tyder på att det är möjligt att få tillgång till information om läkemedelsupptag, metabolism och respons på en enda cellnivå.
Celler reagerar olika på förändringar i deras mikromiljö på Single-cellnivå, ett fenomen som kallas cellulära heterogenitet1. Trots detta, nuvarande Drug discovery studier bygger på genomsnittliga mätningar av cellpopulationer, som fördunkla information om potentiella subpopulationer samt Single-cell variationer2. Denna saknade information kan förklara varför vissa celler är mer mottagliga för droger medan andra är resistenta. Intressant, bristen på Single-cellinformation om läkemedelssvar är en möjlig orsak till misslyckandet av fas II kliniska prövningar av läkemedel3. Därför, för att lösa detta problem, cellulära interaktioner med drogen (dvs, upptag, metabolism, och respons) måste mätas på encelliga nivå.
För att uppnå detta har vi utformat ett unikt system där levande singelceller screenas med hjälp av etikettfri Raman-spektroskopi och därefter karaktäriseras med masspektrometri4. Raman spektroskopi ger ett molekylärt fingeravtryck av det cellulära tillståndet, ett komplext spektrum som följer av bidragen från många molekyler inuti cellen. Trots denna komplexitet, kan det anses att Raman fingeravtryck återspeglar en hel cells struktur och metabolism5,6. Raman spektroskopi utmärker sig vid mätning av cellulära tillstånd i en noninvasiv och relativt hög genomströmning sätt, vilket gör det användbart för screening och bedömning av läkemedelssvar på Single-cellnivå.
Däremot ger medlemsstaterna erforderlig känslighet och selektivitet för att mäta upptaget av läkemedel på encellig nivå. Eftersom MS är destruktivt (provet [cell] vanligtvis förbrukas under analys), integrera det med icke-förstörande, etikettfri Raman spektroskopi kan ge en hög genomströmning och känsligt system. Denna kombinerade plattform kan ge mer information om läkemedelsupptag, metabolism och effekter på encellig nivå.
Detta manuskript belyser ett protokoll som används för att studera cellulära interaktioner med läkemedel på encellig nivå med hjälp av in vitro-kulturer med hjälp av en integrerad Raman-MS-plattform. För att göra detta, hepatocellulära carcinom celler (HepG2) och tamoxifen används som modell. HepG2 celler valdes eftersom de tar upp tamoxifen och metabolisera drogen, och de påverkas samtidigt på grund av dess hepatotoxiska effekter. Två stater används i detta manuskript: läkemedelbehandlade celler kontra icke-behandlade celler (kontroll).
I detta manuskript valdes ett enkelt fall där HepG2 celler exponerades (eller inte) till tamoxifen. Förmågan hos en Raman spektroskopi och masspektrometri system demonstreras för att övervaka effekterna av tamoxifen på celler. Raman spektroskopi tillät identifiering av potentiella biomarkörer som reflekterade en generell respons från enstaka celler till läkemedelsexponering. Vissa heterogenitet mellan enskilda celler observerades, vilket tyder på att vissa celler inte svarade på läkemedelsexponering. Å andra sidan, LSC-MS var kapabel att utföra en riktad analys av läkemedlet och dess metabolit på Single-cellnivå, där en hög grad av heterogenitet observerades i drogen och dess metabolit överflöd. Denna heterogenitet hjälper till att förklara varför vissa celler påverkas av drogen medan andra är till synes inte, trots de celler som härrör från en förment enhetlig befolkning12.
Bland särskilda aspekter av denna teknik som kräver uppmärksamhet, är det viktigt att utvärdera kvaliteten på mikroskopet set-up och signalbehandling för att säkerställa reproducerbarhet av data. Om förbehandling av spektra görs noggrant, bör signalen variationer maximeras på den lokala maximum av varje topp. I motsats till detta bör spektrat och kantens utgångsvärde överlappa varandra mellan de testade cell förhållandena. En annan viktig aspekt är multivariat-modellen som används för att undersöka skillnader mellan behandlingarna. Man måste noggrant utvärdera modellerna och modell parametrarna för att säkerställa en exakt och noggrann analys. En fördel med PLS-modellen, till skillnad från neurala nätverk, är att det ger tillgång till vikter som förknippas med varje våglängd (Raman skift) som bäst skiljer de villkor som testas av modellen.
Trots Raman spektroskopi framgångsrikt diskriminera drogen svar, bör det betonas att denna teknik är begränsad i dess användning för att ge biologisk tolkning. Detta beror främst på komplexiteten i spektralsignalen, som omfattar en blandning av tusentals molekyler. Därför krävs ytterligare utredning för att utvärdera systematiska variationer mellan Ramanspektralintensitet och variationer i läkemedelskoncentrationer. Också, liknande studier av andra cellinjer krävs för att utvärdera generaliseringen av spektralbiomarkers i samband med tamoxifen.
Vidare, det kan vara av intresse att utföra levande vävnader mätningar för att bedöma farmakodynamik och studera hur läkemedel tränger in och flödar inom varje cell. Det bör dessutom noteras att provtagnings steget i LSC-MS är mycket beroende av operatörens skicklighet. Parametrar såsom rumslig upplösning, cell position inuti kapillär efter provtagning, och genomströmning styrka är helt operatörsberoende, vilket begränsar storskaliga antagande av LSC-MS. Även om automatiserade provtagningssystem kan lindra problemet. Dessutom, medan LSC-MS utmärker sig vid provtagning anhängare eller flytande celler i sina inhemska stater, det presterar mer dåligt i provtagning celler inbäddade i Vävnadsdelar. Detta beror på provtagning kapillärspetsen tendens att bryta om provet densitet är hög. Därför kan en annan metod som Single-PROBE vara mer lämpade i sådana fall14,15.
Eftersom de celler som används här samplas i omgivningsförhållanden med minimal provberedning kan LSC-MS enkelt integreras med andra teknologier, vilket framgår av dess integrering med Raman i detta protokoll. En annan liknande integration med 3D holografi har tillåtit för att uppnå absolut kvantifiering av cellulära metaboliter på subcellulära nivå16. Dessutom, integration med flödescytometri har tillåtit för avtäckning av metabola biomarkörer i enstaka cirkulerande tumörceller av neuroblastom cancerpatienter17,18.
I framtiden, på grund av det senaste ökande intresset för att kombinera datauppsättningar från Imaging modaliteter19, det kan också vara av intresse att studera de systematiska variationer mellan Raman signaler och masspektrometri resultat (liksom andra omics metoder) med hjälp av integrativa beräkningsmetoder. Intressant nog har vi redan hittat flera svaga men betydande linjära korrelationer mellan de intensiteter av Raman toppar identifierats av VIP-poäng och överflödet av tamoxifen eller dess metabolit på encellig nivå som identifierats av MS4. Dessa data kan tyda på en metabolisk relation mellan MS Profiles och Raman spectra och möjligheten att förutsäga dessa värden.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Toshio Yanagida för hans stöd och RIKEN interna samarbets fonder tillskrivs Dr Arno germond.
0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
On-stage incubator | ibidi | ||
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |