यहां प्रस्तुत दर्दनाक मस्तिष्क चोट के माउस मॉडल में गैर-आक्रामक मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) डिलीवरी और ट्रैकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है। सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड नैनोकणों को वास्तविक समय एमआरआई का उपयोग करके इंट्रानासाल डिलीवरी के बाद वीवो ट्रैकिंग में एमएससी लेबलिंग और गैर-इनवेसिव के लिए चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) जांच के रूप में नियोजित किया जाता है।
मस्तिष्क की चोटों के लिए स्टेम सेल आधारित उपचार, जैसे दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई), नैदानिक परीक्षणों के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण हैं। हालांकि, इनवेसिव सेल डिलीवरी और कम प्रत्यारोपण दक्षता के साथ ट्रैकिंग जैसी तकनीकी बाधाएं ट्रांसलेशनल स्टेम-आधारित चिकित्सा में चुनौतियां बनी हुई हैं। यह लेख सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड (एसपीआईओ) नैनोकणों के साथ मेसेनचिमल स्टेम सेल (एमएससी) की लेबलिंग के आधार पर स्टेम सेल लेबलिंग और ट्रैकिंग के लिए एक उभरती तकनीक के साथ-साथ लेबल वाले एमएससी की इंट्रानासल डिलिवरी का वर्णन करता है । ये नैनोकण फ्लोरोसेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफवाईटीसी) एम्बेडेड और एमएससी को लेबल करने के लिए सुरक्षित हैं, जिन्हें बाद में इंट्रानासाल मार्ग द्वारा टीबीआई-प्रेरित चूहों के दिमाग में वितरित किया जाता है। वे तो वास्तविक समय चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) द्वारा वीवो में गैर आक्रामक ट्रैक कर रहे हैं । सेल लेबलिंग और इंट्रानासाल डिलीवरी के लिए एसपीआईओ को जोड़ती इस तकनीक के महत्वपूर्ण फायदे लंबी ट्रैकिंग अवधि के लिए डिलीवरी के बाद वीवो एमएससी ट्रैकिंग में (1) गैर-इनवेसिव शामिल हैं, (2) गैर-आक्रामक के कारण कई खुराक रेजीडेंस की संभावना एमएससी डिलीवरी का मार्ग, और (3) एसपीआईओ की सुरक्षा, एमआरआई द्वारा सेल-ट्रैकिंग विधि की गैर-आक्रामक प्रकृति, और प्रशासन के मार्ग के कारण मनुष्यों के लिए संभावित अनुप्रयोग।
मेसेनचिमल स्टेम सेल (एमएससी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) विकारों और मनुष्यों में चोटों के उपचार में स्टेम सेल आधारित चिकित्सा के लिए आकर्षक उम्मीदवार हैं। इसके अलावा, एमएससी चोट साइटों1,2पर चिकित्सीय प्रोटीन के वितरण के लिए एक वाहन के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हाल के वर्षों में, सीएनएस विकारों के स्टेम सेल-आधारित उपचारों के लिए सेल ट्रैकिंग सेल-सेल-आधारित 1) सेल डिलीवरी के उपन्यास मार्गों को स्थापित करने के लिए आशाजनक नवाचार विकसित किए गए हैं। मस्तिष्क में स्टेम कोशिकाओं का अरण्य वितरण कोशिकाओं की क्रिब्रिफॉर्म प्लेट को बाईपास करने और पैरानचिमल मार्ग3के माध्यम से आंशिक रूप से घ्राण बल्ब में प्रवेश करने की क्षमता पर निर्भर करता है । इंट्रानासाल डिलीवरी का संयोजन और सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड (एसपीआईओ) नैनोकणों के साथ एमएससी की लेबलिंग सीएनएस विकारों के इलाज में एमएससी के नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है, क्योंकि एसपीआईओ नैनोकण चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के लिए सुरक्षित जांच करते हैं और एमआरआई3,4,5द्वारा एमएससी पोस्ट-डिलीवरी के गैर-आक्रामक संवेदनशील देशीयमुख ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, इंट्रानासाल डिलीवरी एक सुरक्षित और गैर-आक्रामक मार्ग है जो थोड़े समय के भीतर प्रशासन को दोहराने की अनुमति देता है।
यह लेख दर्दनाक मस्तिष्क चोट (टीबीआई) के माउस मॉडल में वीवो पोस्ट-इंट्रानासाल डिलीवरी में एमएससी पर नज़र रखने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील और गैर-आक्रामक तकनीक का वर्णन करता है, जो SPIO-लेबल कोशिकाओं और एमआरआई को रोजगार देता है। SPIO लेबलिंग का एक महत्वपूर्ण लाभ एमआरआई द्वारा ऊतक में एसपीआईओ का संवेदनशील पता लगाना है, जो कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक और गैर-आक्रामक रूप से ट्रैक करना संभव बनाता है। यहां उपयोग किए जाने वाले एसपीआईओ नैनोकण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफवाईटीसी) फ्लोरोफोर के साथ टैग किए गए हैं, जो इम्यूनोस्टेनिंग या अतिरिक्त प्रसंस्करण के बिना ऊतक में एसपीआईओ का पता लगाने की अनुमति देता है। इसके अलावा, देशीयतर वास्तविक समय ट्रैकिंग करना और वितरित एमएससी के जैव वितरण की जांच करना संभव है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एमएससी के एसपीआईओ लेबलिंग और एसपीआईओ लेबल वाले एमएससी पोस्ट-इंट्रानासाल डिलीवरी की एमआरआई ट्रैकिंग के लिए सामान्य प्रक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करता है । प्रोटोकॉल एक गैर-आक्रामक विधि का उपयोग करके मस्तिष्क में वीवो में एमएससी पोस्ट-डिलीवरी के माइग्रेशन और बायोडिस्ट्रीब्यूशन का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है।
एमएससी सीएनएस विकारों और चोटों के लिए स्टेम सेल आधारित उपचारों के लिए आकर्षक उम्मीदवार हैं, जो ट्रोफिक कारकों को स्रावित करने की उनकी क्षमता के कारण हैं जो 1) न्यूरोरेस्टोरेटिव प्रक्रियाओं और 2 को ट्रिगर करते हैं) चोट क्षेत्र9,10,11,12के भीतर उनके विरोधी भड़काऊ प्रभावों के कारण न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करते हैं। हालांकि लंबी अवधि के एमआरआई ट्रैकिंग और SPIO लेबल MSCs का पता लगाने सेल डिवीजन के साथ इंटरसेलुलर SPIO के कमजोर पड़ने के कारण सीमित किया जा सकता है, लेबल कोशिकाओं को कई हफ्तों तक के लिए पशु मॉडल13के दिमाग में प्रत्यारोपण के बाद पता लगाया जा सकता है ।
इसके अलावा यहां वर्णित SPIO नैनोकणों के साथ MSCs के लेबलिंग प्रोटोकॉल ट्रांसफेक्शन एजेंटों के बिना dextran के साथ लेपित है । साहित्य में14,15,16अन्य प्रोटोकॉल का प्रयोग किया गया है . हालांकि, सभी मामलों में, इन प्रोटोकॉलों को सेल प्रकार, एसपीआईओ आकार, ऊष्मायन समय और एसपीआईओ एकाग्रता के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। एमएससी में कोनड्रोजेनिक विभेदन क्षमता को बिगड़ा हुआ दिखाया गया है , लेकिन एसपीआईओ लेबलिंग17पर आदिजेनिक भेदभाव नहीं है । इसलिए, यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि स्टेम सेल की विभेदन शक्ति पर एसपीआईओ के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए स्टेम सेल डिलीवरी से पहले भेदभाव परख किया जाए। पिछले अध्ययन में, यह दर्शाया गया था कि यहां उपयोग किए जाने वाले एक ही एसपीआईओ प्रकार और एकाग्रता के साथ एमएससी लेबलिंग ने एमएससी6की ऑस्टियोजेनिक या आदिजेनिक भेदभाव शक्ति को प्रभावित नहीं किया।
मस्तिष्क विकारों और चोटों के लिए चिकित्सीय स्टेम सेल वितरण का इंट्रानासाल मार्ग स्टेम कोशिकाओं के नैदानिक अनुप्रयोग के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। हालांकि, नाक गुहा में स्टेम कोशिकाओं के व्यवहार हुक्म है कि आंतरिक और आणविक तंत्र अस्पष्ट रहते हैं । यद्यपि छोटे अणुओं के वितरण के लिए अंतरनासाल मार्ग का व्यापक रूप से पता लगाया जाता है, लेकिन चिकित्सीय स्टेम का आकार और जैव वितरण व्यवहार छोटे अणुओं से भिन्न होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एमएससी इंट्रानासाल डिलीवरी के बाद चोट साइट की ओर माइग्रेट करते हैं।
यहां, टी2 * भारित छवियों का उपयोग एसपीआईओ लेबल वाले एमएससी को ट्रैक करने के लिए किया गया था । अन्य रिपोर्टों में ढाल इको इमेजिंग का इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, संवेदनशीलता कलाकृतियों को अक्सर इंटरसेलुलर एसपीआईओ के कारण ढाल इको इमेजिंग में देखा जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, टी 2 * भारित छवियों पर SPIO लेबल MSCs का प्रतिनिधित्व करने वाले हाइपोतीव्र क्षेत्रों का स्थान मस्तिष्क वर्गों में एसपीआईओ के स्थान के समान था जैसा कि हिस्टोलॉजिकल परीक्षा(चित्र 3)द्वारा पता चला। यह मस्तिष्क में SPIO लेबल एमएससी ट्रैकिंग के लिए T2 * भारित स्पिन इको इमेजिंग की पर्याप्त संवेदनशीलता को इंगित करता है ।
संक्षेप में, वर्णित प्रोटोकॉल मस्तिष्क चोटों और विकारों के वीवो स्टेम सेल ट्रैकिंग अध्ययन में फायदेमंद है। वीवो में स्टेम सेल की देशीयतरबां वाली ट्रैकिंग पारंपरिक रूप से कई टाइमपॉइंट पर जानवरों का त्याग करके किया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल एमएससी डिलीवरी और ट्रैकिंग के लिए एक गैर-आक्रामक और कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो नैदानिक सेटिंग्स में मस्तिष्क चोटों और विकारों के लिए स्टेम सेल-आधारित चिकित्सा के लिए एक संभावित प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुदान मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था, ताइवान (सबसे 104-2923-बी-038-004-MY2, सबसे 107-2314-B-038-063, और सबसे 107-2314-B-038-042) और ताइपे मेडिकल यूनिवर्सिटी (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 और DP2-108-21121-01-N-05-01-01-01)।
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |