Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Summary

Neurale Stamm-/Vorläuferzellen weisen verschiedene Expressionsdynamiken von Notch-Signalkomponenten auf, die zu unterschiedlichen Ergebnissen zellulärer Ereignisse führen. Eine solche dynamische Expression kann durch Echtzeitüberwachung und nicht durch statische Analyse mit einem hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildgebungssystem, das die Visualisierung schneller Veränderungen von Genausdrücken ermöglicht, aufgedeckt werden.

Abstract

Die Notch-Signalisierung reguliert die Aufrechterhaltung von neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen durch Zell-Zell-Wechselwirkungen. Die Komponenten der Notch-Signalisierung weisen einen dynamischen Ausdruck auf. Notch-Signaleffektor Hes1 und der Kerbliganand Delta-like1 (Dll1) werden oszillatonisch in neuralen Stamm-/Vorläuferzellen exprimiert. Da die Periode der oszillatorischen Expression dieser Gene sehr kurz ist (2 h), ist es schwierig, ihre zyklische Expression zu überwachen. Um solche schnellen Veränderungen in der Genexpression oder Proteindynamik zu untersuchen, sind schnell reagierende Reporter erforderlich. Aufgrund seiner schnellen Reifungskinetik und hohen Empfindlichkeit eignet sich der Biolumineszenzreporter luciferase, um schnelle Genexpressionsänderungen in lebenden Zellen zu überwachen. Wir verwendeten einen destabilisierten Luziferase-Reporter zur Überwachung der Promotoraktivität und einen luziferase-gebundenen Reporter zur Visualisierung der Proteindynamik bei Einzelzellauflösung. Diese Biolumineszenz-Reporter zeigen einen schnellen Umsatz und erzeugen sehr schwache Signale; Daher haben wir ein hochempfindliches Biolumineszenz-Bildgebungssystem entwickelt, um solche schwachen Signale zu erkennen. Diese Methoden ermöglichen es uns, verschiedene Genexpressionsdynamiken in lebenden Zellen und Geweben zu überwachen, die wichtige Informationen sind, um die tatsächlichen Zellzustände zu verstehen.

Introduction

Das Säugetiergehirn besteht aus einer großen Anzahl von verschiedenen Arten von Neuronen und Gliazellen. Alle Zellen werden aus neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen (NPCs) erzeugt, die sich zuerst vermehren, um ihre Anzahl zu erweitern, dann beginnen, sich in Neuronen zu differenzieren, und schließlich zu Gliazellen^1,2,3,4,5führen. Sobald sich die Zellen in Neuronen differenziert haben, können sie sich nicht vermehren oder ihre Anzahl erhöhen, und daher ist die Aufrechterhaltung von NPCs bis zu späteren Stadien wichtig. Die Notch-Signalisierung über Zell-Zell-Interaktionen spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der NPCs^6,7. Kerbliganden interagieren mit dem Membranprotein Notch auf der Oberfläche benachbarter Zellen und aktivieren das Kerbprotein. Nach der Aktivierung tritt eine Proteolyse des Kerbproteins auf, wodurch die intrazelluläre Domäne von Notch (NICD) aus der Zellmembran in den Zellkern^8,9,10freigesetzt wird. Im Kern bindet NICD an die Förderregionen Hes1 und Hes5 (Hes1/5) und aktiviert die Expression dieser Gene. Hes1/5 unterdrücken die Expression der proneuralen Gene Ascl1 und Neurogenin1/2 (Neurog1/2)^11,12,13,14. Da proneurale Gene neuronale Differenzierung induzieren, spielen Hes1/5 eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung von NPCs. Da proneurale Gene die Expression des Kerbliganden Delta-like1 (Dll1) aktivieren können, reprimiert Hes1/5 auch die Expression von Dll1. Daher führt die Expression von Dll1 dazu, dass benachbarte Zellen für Dll1 über Notch-Signalisierung negativ sind. Auf diese Weise hemmen Zellen benachbarte Zellen daran, ihrem gleichen Schicksal zu folgen, ein Phänomen, das als laterale Hemmung bekannt ist⁸. Im sich entwickelnden Gehirn spielt die laterale Hemmung eine Rolle bei der Erzeugung verschiedener Zelltypen.

Die Echtzeit-Bildgebung auf Einzelzellebene zeigt dynamische Ausdrücke der Komponenten der Notch-Signalisierung in NPCs^15,16,17. Notch Signalisierung aktiviert die Expression von Hes1, aber Hes1 Protein bindet an seinen eigenen Promotor und unterdrückt seinen eigenen Ausdruck. Darüber hinaus ist Hes1 ein extrem instabiles Protein, das durch den Ubiquitin-Proteasomen-Weg abgebaut wird; Daher ist die Repression des eigenen Förderers nur von kurzer Dauer und dann beginnt die Transkription wieder. Auf diese Weise oszilliert der Ausdruck von Hes1 sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene in einem 2 h-Zyklus¹⁸. Die oszillierende Expression von Hes1 wiederum induziert die oszillierende Expression der nachgeschalteten Zielgene, wie Ascl1, Neurog2 und Dll1, durch periodische Repression^15,16,17,19. Während proneurale Gene neuronale Differenzierung induzieren können, reicht ihre oszillierende Expression für eine neuronale Differenzierung nicht aus; vielmehr ist ihr nachhaltiger Ausdruck für die neuronale Differenzierung unerlässlich. Die oszillatorische Expression von proneuralen Genen ist wichtig für die Aufrechterhaltung von NPCs und nicht für die Induktion neuronaler Differenzierung^14,15,16. Die Expression von Dll1 oszilliert sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene während verschiedener Morphogenese, wie Neurogenese und Somitogenese. Die dynamische Expression von Dll1 ist wichtig für die normale Morphogenese und die stetige Expression von Dll1 induziert Defekte in der Neurogenese und Sogenese¹⁷. Diese Ergebnisse zeigen die wichtige Funktion, die die Dynamik der Genexpression und Proteinkinetik auf die Regulation verschiedener Entwicklungsereignisse hat (d.h. unterschiedliche Expressionsdynamiken erzeugen unterschiedliche Outputs im zellulären Verhalten).

Um die Dynamik der Notch-Signalisierung zu analysieren, reicht die statische Analyse von Geweben und Zellen nicht aus, da sie sich ständig ändern. Die Echtzeit-Bildgebung einzelner Zellen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik in der Genexpression zu offenbaren. Die dynamische Expression von Notch-Signalmolekülen erfährt im Zeitraum von 2-3 h schnelle zyklische Reaktionen. Diese schnelle periodische Expression stellt die Echtzeitüberwachung vor zwei schwierige Probleme: (1) Die Expression der Moleküle wird auf ein niedriges Niveau unterdrückt, und (2) ein schneller Fluktuation erfordert schnell reagierende Reporter. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir zuvor eine Biolumineszenz-Echtzeit-Bildgebungsmethode²⁰entwickelt. Da der Biolumineszenzreporter eine höhere Empfindlichkeit und kürzere Reifezeit hat als fluoreszierende Reporter, ermöglicht uns diese Strategie, die schnelle Dynamik in lebenden Zellen zu überwachen. Anhand der Echtzeit-Visualisierung stellten wir fest, dass mehr Gene eine dynamische Expression aufwiesen, als wir bisher dachten. Darüber hinaus hat die Zahl der Berichte, die Expression und Proteindynamik in lebenden Zellen und die Bedeutung dieser Dynamik in verschiedenen biologischen Ereignissen zeigen, zugenommen, was auf eine grundlegende Rolle der Dynamik in den Genausdrücken^21,22hindeutet.

In diesem Bericht beschreiben wir eine Möglichkeit, den Ausdruck der Kerb Liganden Dll1 in NPCs sowohl in dissoziierten Kulturen als auch in kortikalen Scheibenkulturen zu visualisieren. Um die Dynamik der Dll1-Transkription auf Einzelzellebenen zu überwachen, erzeugten wir dissoziierte Kulturen von NPCs, die aus dem embryonalen Telencephalon von transgenen Mäusen abgeleitet wurden, die pDll1-Ub-Fluc-Reporter trugen, einen Dll1-Promotor-gesteuerten destabilisierten Luziferase-Reporter. Um die Dll1-Proteindynamik in vivo zu überwachen, führten wir den Dll1-Fluc-Fusionsreporter in NPCs im Kortex ein und visualisierten den Ausdruck des Reporters in NPCs in kortikalen Scheibenkulturen. Die Echtzeit-Bildgebung ermöglichte es uns, die verschiedenen Merkmale der Genexpression und Proteindynamik in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu erfassen.

Protocol

Alle Verfahren einschließlich tierischer Fächer wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Institut für Grenzleben und Medizinische Wissenschaften der Universität Kyoto genehmigt. 1. Biolumineszenz-Reporter HINWEIS: Der luziferase-Reporter eignet sich zur Messung der schnellen Dynamik der Promotoraktivität durch Verschmelzung des Degradationssignals. Darüber hinaus ermöglicht der luziferase Fusion Reporter die Überwachung der Proteindynamik in d…

Representative Results

Ausdrücke der Gene Hes1/7 weisen 2 h Oszillationszyklus in verschiedenen Zelllinien und während der Sonogenese auf. Darüber hinaus ist die Schwingungsdauer sehr kurz und sowohl ihre mRNAs als auch ihre Proteine sind mit einer Halbwertszeit von etwa 20 min extrem instabil. Wenn wir einen Reporter mit langsamer Reaktion verwenden, können wir eine solche schnelle Dynamik nicht verfolgen, und wenn wir einen stabilen Reporter verwenden, akkumuliert er sich allmählich, während die Genexpression oszilliert. Daher…

Discussion

Die Komponenten der Notch-Signalisierung zeigen oszillatorischen Ausdrücke synchron während der Synchronität während der Neurogenese, was zu den Schwierigkeiten führt, die Expressionsdynamik durch statische Analyse im letzteren Fall zu erfassen. Daher ist eine Echtzeitüberwachung erforderlich, um die Ausdrucksdynamik von Notch-Signalkomponenten wie Hes1 und Dll1zu zeigen. Da die Perioden der Ausdrücke von Hes1 und Dll1 Schwingungen extrem kurz sind, etwa 2-3 h, sind schnelle Rea…

Materials

Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller)	Julabo	Model: F12-ED
Cooled CCD camera	Andor Technology	Model: iKon-M 934
Incubator system	TOKAI HIT	Model: INU-ONICS
Inverted microscope	Olympus	Model: IX81
Inverted microscope	Olympus	Model: IX83
LED illumination device	CoolLED	Model: pE1
MetaMorph	MOLECULAR DEVICES	Model: 40000
Mix gas controller	Tokken	Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens	Olympus	Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope	Nikon	Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope	Leica	Model: MZ16FA
Fine forceps	DUMONT	INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish	greiner	664160-013
35-mm plastic petri dish	greiner	627160
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
DMEM/F12	invitrogen	11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement	invitrogen	12587-010
bFGF	invitrogen	13256-029	Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin	Nacalai Tesque	01493-85	Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase	Worthington Biochemical Corporation	LK003172	Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS	Worthington Biochemical Corporation	LK003188
Glass bottom dish	IWAKI	3910-035
N2 supplement (100x)	invitrogen	17502-048
N-acetyl-cystein	Sigma	A-9165-25G
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LK003178	Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine	Nacalai Tesque	09367-34
Poly-L-lysine	Sigma	P-6281	40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe	TERUMO	181228T
Electrode	Neppagene	7-mm
Electroporator	Neppagene	CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes	Kawamoto co.	7161
Micro capillary	Made in-house
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
Pentbarbital	Kyoritsuseiyaku	Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle	Akiyama MEDICAL MFG. CO	F17-40B2
Xylazine	Bayer	Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish	greiner	664160-013
35-mm plastic petri dish	greiner	627160
Culture insert	Millipore	PICM01250
DMEM/F12	invitrogen	11039-021
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012-500ML
Fine forceps	DUMONT	INOX No.5
Forceps
Horse Serum	Gibco	16050-122
Micro surgical knife	Alcon	19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator	Panasonic	MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media	Made in-house		ref. NPC dissociatioin culture
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board	Made in-house