मॉरिन न्यूरोजेनेसिस के दौरान नॉच सिग्नलिंग डायनेमिक्स की रियल-टाइम बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग
Summary
तंत्रिका स्टेम/जनक कोशिकाएं नॉच सिग्नलिंग घटकों की विभिन्न अभिव्यक्ति गतिशीलता प्रदर्शित करती हैं जो सेलुलर घटनाओं के विभिन्न परिणामों का कारण बनती हैं । इस तरह की गतिशील अभिव्यक्ति वास्तविक समय की निगरानी से प्रकट किया जा सकता है, स्थिर विश्लेषण से नहीं, एक अत्यधिक संवेदनशील बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके जो जीन अभिव्यक्तियों में तेजी से परिवर्तन के दृश्य को सक्षम बनाता है।
Abstract
नॉच सिग्नलिंग सेल-सेल इंटरैक्शन द्वारा तंत्रिका स्टेम/जनक कोशिकाओं के रखरखाव को नियंत्रित करता है । नॉच सिग्नलिंग के घटक गतिशील अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं। नॉच सिग्नलिंग इफेक्टर हेस1 और नॉच लिगामेंट डेल्टा-लाइक1 (Dll1) को तंत्रिका स्टेम/प्रोजेनिटर कोशिकाओं में दोलन तरीके से व्यक्त किया जाता है । क्योंकि इन जीनों की ऑसिलेक्टरी एक्सप्रेशन की अवधि बहुत कम (2 एच) होती है, इसलिए उनकी चक्रीय अभिव्यक्ति पर नजर रखना मुश्किल होता है। जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन गतिशीलता में इस तरह के तेजी से परिवर्तन की जांच करने के लिए, तेजी से प्रतिक्रिया संवाददाताओं की आवश्यकता है । अपनी तेजी से परिपक्वता गतिज और उच्च संवेदनशीलता के कारण, बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर लूसिफेरेज़ जीवित कोशिकाओं में तेजी से जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन ों की निगरानी करने के लिए उपयुक्त है। हम प्रमोटर गतिविधि की निगरानी के लिए एक अस्थिर लूसिफ़ेरेज रिपोर्टर का इस्तेमाल किया और एकल सेल संकल्प पर प्रोटीन गतिशीलता की दृश्य के लिए एक लूसिफ़ेरेज-फ्यूज्ड रिपोर्टर । ये बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर्स तेजी से कारोबार दिखाते हैं और बहुत कमजोर संकेत पैदा करते हैं; इसलिए, हमने ऐसे बेहोश संकेतों का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम विकसित किया है। ये विधियां हमें जीवित कोशिकाओं और ऊतकों में विभिन्न जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता की निगरानी करने में सक्षम बनाती हैं, जो वास्तविक सेलुलर राज्यों को समझने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी हैं।
Introduction
स्तनधारी मस्तिष्क बड़ी संख्या में विभिन्न प्रकार के न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं से बना है। सभी कोशिकाएं तंत्रिका स्टेम/जनक कोशिकाओं (एनपीसी) से उत्पन्न होती हैं, जो पहले अपनी संख्या का विस्तार करने के लिए पैदा होती हैं, फिर न्यूरॉन्स में अंतर करना शुरू करती हैं, और अंत में ग्लियल कोशिकाओं को जन्म देती हैं1,2,3,4,5। एक बार कोशिकाओं को न्यूरॉन्स में अंतर कर दिया है, वे पैदा या अपनी संख्या में वृद्धि नहीं कर सकते हैं, और इसलिए, बाद के चरणों तक NPCs के रखरखाव महत्वपूर्ण है । सेल-सेल इंटरैक्शन के माध्यम से पायदान सिग्नलिंग एनपीसी6,7को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । पायदान लिगांड पड़ोसी कोशिकाओं की सतह पर झिल्ली प्रोटीन, पायदान के साथ बातचीत करते हैं और नॉच प्रोटीन को सक्रिय करते हैं। सक्रियण के बाद, नॉच प्रोटीन का प्रोटेलियोलिसिस होता है, जिससे कोशिका झिल्ली से नॉभलियस8,9,10में नॉच (एनआईसीडी) के इंट्रासेल्युलर डोमेन को जारी किया जाता है। नाभिक में, एनआईसीडी Hes1 और Hes5 (Hes1/5)के प्रमोटर क्षेत्रों को बांधता है और इन जीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है । Hes1/5 प्रवण जीन Ascl1 और Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14की अभिव्यक्ति को दबाना । क्योंकि प्रवण जीन न्यूरोनल भेदभाव को प्रेरित करते हैं, Hes1/5 एनपीसी को बनाए रखने में आवश्यक भूमिकाएं निभाते हैं । इसके अलावा, के रूप में प्रवण जीन पायदान लिगांड डेल्टा की अभिव्यक्ति को सक्रिय कर सकते है-like1 (Dll1), Hes1/5 भी Dll1की अभिव्यक्ति को दबाना । इसलिए, Dll1 की अभिव्यक्ति पड़ोसी कोशिकाओं को नॉच सिग्नलिंग के माध्यम से Dll1 के लिए नकारात्मक होने की ओर ले जाती है। इस तरह, कोशिकाएं आसन्न कोशिकाओं को उनके समान भाग्य का पालन करने से रोकती हैं, एक घटना जिसे पार्श्व अवरोध8के रूप में जाना जाता है। विकासशील मस्तिष्क में, पार्श्व अवरोध विभिन्न विभिन्न कोशिका प्रकारों को उत्पन्न करने में भूमिका निभाता है।
एकल कोशिका स्तर पर रीयल – टाइम इमेजिंग एनपीसी15,16,17में नॉच सिग्नलिंग के घटकों की गतिशील अभिव्यक्ति का पता चलता है । नॉच सिग्नलिंग Hes1की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है, लेकिन Hes1 प्रोटीन अपने प्रमोटर को बांधता है और अपनी अभिव्यक्ति को दबाता है। इसके अलावा, Hes1 एक अत्यंत अस्थिर प्रोटीन है, जो सर्वव्यापी-प्रोटेसोम मार्ग से अपमानित है; इसलिए, अपने स्वयं के प्रमोटर का दमन केवल अल्पकालिक होता है और फिर प्रतिलेखन फिर से शुरू होता है। इस तरह, Hes1 की अभिव्यक्ति 2 एच चक्र18में प्रतिलेखन और अनुवाद दोनों स्तरों पर दोलन करती है। हे1 की आदोलनीय अभिव्यक्ति,बदले में, आवधिक दमन15,16,17,19के माध्यम से एसीसीएल 1, न्यूरोजी2 और Dll1 जैसे डाउनस्ट्रीम लक्ष्य जीन की दोलन अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है। जबकि प्रवण जीन न्यूरोनल भेदभाव को प्रेरित कर सकते हैं, उनकी दोलन अभिव्यक्ति न्यूरोनल भेदभाव के लिए पर्याप्त नहीं है; बल्कि उनकी निरंतर अभिव्यक्ति न्यूरोनल भेदभाव के लिए आवश्यक है। न्यूरोनल विभेदन14,15,16को प्रेरित करने के बजाय एनपीसी को बनाए रखने के लिए प्रवणीय जीन की आदोलनात्मक अभिव्यक्ति महत्वपूर्ण है । Dll1 की अभिव्यक्ति न्यूरोजेनेसिस और सोमिटोजेनेसिस जैसे विभिन्न मॉर्फोजेनेसिस के दौरान ट्रांसक्रिप्शन और ट्रांसलेशनल दोनों स्तरों पर दोलन करती है। Dll1 की गतिशील अभिव्यक्ति सामान्य मॉर्फोजेनेसिस के लिए महत्वपूर्ण है और Dll1 की स्थिर अभिव्यक्ति न्यूरोजेनेसिस और सोमिटोजेनेसिस17में दोषलाती है । ये निष्कर्ष विभिन्न विकासात्मक घटनाओं के नियमन पर जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन काइनेटिक्स की गतिशीलता वाले महत्वपूर्ण कार्य को प्रदर्शित करते हैं (यानी, विभिन्न अभिव्यक्ति गतिशीलता सेलुलर व्यवहार में विभिन्न आउटपुट का उत्पादन करती है)।
नॉच सिग्नलिंग की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए, ऊतकों और कोशिकाओं का स्थिर विश्लेषण अपर्याप्त है क्योंकि वे लगातार बदल रहे हैं। एकल कोशिकाओं की वास्तविक समय इमेजिंग जीन अभिव्यक्ति में गतिशीलता को प्रकट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। नॉच सिग्नलिंग अणुओं की गतिशील अभिव्यक्ति 2-3 घंटे की अवधि में तेजी से चक्रीय प्रतिक्रियाओं से गुजरती है। यह तेजी से आवधिक अभिव्यक्ति वास्तविक समय की निगरानी के लिए दो कठिन समस्याओं को प्रस्तुत करता है: (1) अणुओं की अभिव्यक्ति को निम्न स्तर तक दबा दिया जाता है, और (2) तेजी से कारोबार के लिए तेजी से प्रतिक्रिया संवाददाताओं की आवश्यकता होती है। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने पहले एक बायोल्यूमिनेसेंस रियल-टाइम इमेजिंग विधि20विकसित की थी। क्योंकि बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और कम परिपक्वता समय है, यह रणनीति हमें जीवित कोशिकाओं में तेजी से गतिशीलता की निगरानी करने में सक्षम बनाती है। वास्तविक समय दृश्य का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि अधिक जीन गतिशील अभिव्यक्ति का प्रदर्शन से हम पहले सोचा था । इसके अलावा, जीवित कोशिकाओं में अभिव्यक्ति और प्रोटीन गतिशीलता और विभिन्न जैविक घटनाओं में इन गतिशीलता के महत्व को दिखाने वाली रिपोर्टों की संख्या में वृद्धि हुई है, जो जीन अभिव्यक्तियों21,22में गतिशीलता की मौलिक भूमिका का सुझाव देता है।
इस रिपोर्ट में, हम दोनों विसोसिएटसंस्कृतियों और कॉर्टिकल स्लाइस संस्कृतियों में एनपीसी में नॉच लिगांड Dll1 की अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए एक तरीका का वर्णन करते हैं । एकल सेल स्तर पर Dll1 प्रतिलेखन की गतिशीलता की निगरानी करने के लिए, हमने पीडीसी1-यूबी-फ्लूक रिपोर्टर, एक Dll1 प्रमोटर संचालित अस्थिर लूसिफ़ेरे रिपोर्टर को ले जाने वाले ट्रांसजेनिक चूहों के भ्रूण टेलेंसेफेलोन से प्राप्त एनपीसी की विसोशिएट संस्कृतियों को उत्पन्न किया। वीवो में Dll1 प्रोटीन गतिशीलता की निगरानी के लिए, हमने कॉर्टेक्स में एनपीसी में Dll1-Fluc फ्यूजन रिपोर्टर पेश किया और कॉर्टिकल स्लाइस संस्कृतियों में एनपीसी में रिपोर्टर की अभिव्यक्ति की कल्पना की । रीयल-टाइम इमेजिंग ने हमें उच्च लौकिक संकल्प पर जीवित कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन गतिशीलता की विभिन्न विशेषताओं को पकड़ने में सक्षम बनाया।
Protocol
Representative Results
Discussion
नॉच सिग्नलिंग के घटक सोमिटोजेनेसिस के दौरान सिंक्रोनी में दोलन अभिव्यक्ति दिखाते हैं लेकिन न्यूरोजेनेसिस के दौरान सिंक्रोनी से बाहर होते हैं, जिससे बाद के मामले में स्थिर विश्लेषण द्वारा अभिव्यक्त…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वीडियो के उत्पादन का समर्थन करने के लिए Yumiko Iwamoto शुक्रिया अदा करते हैं । हम इमेज एनालिसिस की चर्चा और समर्थन के लिए अकिहिरो इसोमुरा के आभारी भी हैं, ट्रांसजेनिक जानवरों की पीढ़ी के लिए तकनीकी समर्थन के लिए हितोशी मियाची, युजी शिंजो (ओलंपस मेडिकल साइंस), मासातोशी इगावा (ओलंपस मेडिकल साइंस), ताकुया इशिज़ु (ओलंपस मेडिकल साइंस), ताकुया इशिज़ु ( ओलंपस मेडिकल साइंस) और ओइन कुनिताकी (एंडोर जापान) बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम की तकनीकी सहायता और चर्चाओं के लिए। इस काम को कोर रिसर्च फॉर इवोल्यूशनल साइंस एंड टेक्नोलॉजी (जेपीएमजेसीआर12डब्ल्यू2) (आरके), इनोवेटिव एरियापर साइंटिफिक रिसर्च के लिए ग्रांट-इन-एड (एचएस के लिए एमईएक्सटी 24116705 और आरकेएस के लिए एमईएक्सटी 16एच06480), ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (सी) (जेएसपीएस) द्वारा समर्थित किया गया था। 18K06254) (एचएस), Takeda फाउंडेशन (आरके और एचएस), और शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी, जापान मंत्रालय से रहने की प्रणाली के लिए गतिशील दृष्टिकोण के लिए मंच ।
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
Referências
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