Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

Summary

Células de tronco neural/progenitor apresentam várias dinâmicas de expressão de componentes de sinalização notch que levam a diferentes resultados de eventos celulares. Essa expressão dinâmica pode ser revelada pelo monitoramento em tempo real, não pela análise estática, usando um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível que permite a visualização de mudanças rápidas nas expressões gênicas.

Abstract

A sinalização de notch regula a manutenção de células-tronco/progenitoras neurais por interações célula-célula. Os componentes da sinalização notch exibem expressão dinâmica. Notch sinalização efetor Hes1 e o Notch ligand Delta-like1 (Dll1) são expressos de forma oscilatória em células de tronco neural / progenitor. Como o período de expressão oscilatória desses genes é muito curto (2 h), é difícil monitorar sua expressão cíclica. Para examinar tais mudanças rápidas na expressão do gene ou na dinâmica da proteína, os repórteres rápidos da resposta são exigidos. Devido à sua rápida maturação cinética e alta sensibilidade, o repórter de bioluminescência luciferase é adequado para monitorar mudanças rápidas de expressão gênica nas células vivas. Usamos um repórter lúciferase desestabilizado para monitorar a atividade do promotor e um repórter luciferase fundido para visualização da dinâmica de proteínas na resolução de célulaúnica. Estes repórteres da bioluminescência mostram o retorno rápido e geram sinais muito fracos; Portanto, desenvolvemos um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível para detectar tais sinais fracos. Esses métodos nos permitem monitorar várias dinâmicas de expressão gênica em células vivas e tecidos, que são informações importantes para ajudar a entender os estados celulares reais.

Introduction

O cérebro de mamíferoé composto por um grande número de vários tipos de neurônios e células gliais. Todas as células são geradas a partir de células de tronco neural /progenitoras (NPCs), que primeiro proliferam para expandir seus números, em seguida, começam a se diferenciar em neurônios e, finalmente, dar origem às células gliais^1,2,3,4^,5. Uma vez que as células se diferenciaram em neurônios, elas não podem proliferar ou aumentar seus números e, portanto, a manutenção de NPCs até estágios posteriores é im....

Protocol

Todo o procedimento, incluindo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee no instituto de Frontier Life and Medical Sciences, Universidade de Kyoto.

1. Repórteres de bioluminescência

NOTA: O repórter luciferase é adequado para medir a dinâmica rápida da atividade promotora, fundindo o sinal de degradação. Além disso, o repórter de fusão luciferase permite o monitoramento da dinâmica proteica na única célula. Ambos os tipos de repórteres estão disponíveis para a cultura mono-camada (cultura da dissociação) e a cultura do tecido (cultura da fatia) experiência.

1. Repó....

Results

Expressões dos genes Hes1/7 exibem 2 h ciclo de oscilação em várias linhas celulares e durante a somitogênese. Além disso, o período de oscilação é muito curto e tanto os seus mRNAs como as proteínas são extremamente instáveis, com a meia-vida de cerca de 20 min. Se usar um repórter de resposta lenta, não podemos rastrear uma dinâmica tão rápida, e se usar um repórter estável, ele gradualmente se acumula enquanto a expressão gênica oscila. Assim, o repórter deve ser rapidamente degradado para monitorar a rápida .......

Discussion

Os componentes da sinalização notch mostram expressões oscilatórias em sincronia durante a somitogênese, mas fora de sincronia durante a neurogênese, levando às dificuldades em capturar a dinâmica de expressão por análise estática neste último caso. Assim, o monitoramento em tempo real é necessário para revelar a dinâmica de expressão dos componentes de sinalização notch, como Hes1 e Dll1. Porque os períodos das expressões das oscilações de Hes1 e Dll1 são extremamente curtos, aproxima.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de imagem de bioluminescência
Circulador de água gelada (chiller)	Julabo	Modelo: F12-ED
Câmera CCD refrigerada	Andor Technology	Modelo: iKon-M 934
Sistema de incubadora	TOKAI HIT	Modelo: INU-ONICS
Microscópio invertido	Olympus	Modelo: IX81
Microscópio invertido	Olympus	Modelo: IX83
Dispositivo de iluminação LED	CoolLED	Modelo: pE1
MetaMorph	MOLECULAR DEVICES	Modelo: 40000
Controlador de gás misto	Tokken	Modelo: TK-MIGM OLO2
Lente objetiva	Olympus	Modelo: UPLFLN 40X O
Preparações para dissecção
Microscópio de dissecação	Nikon	Modelo: SMZ-2B
Microscópio estereoscópico de fluorescência	Leica	Modelo: MZ16FA
Pinça fina	DUMONT	INOX No.5
Tesoura, Micro tesoura
Pinça
Pinça
10 cm de plástico	Graxa	664160-013
35 mm de plástico	Graxa	627160
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
DMEM/F12	invitrogen	11039-021
Reagentes para NPC cultura de dissociação
B27 suplemento	invitrogen	12587-010
bFGF	invitrogen	13256-029	Solução de estoque: 1 μ g/ml em 0,1% BSA/PBS
D-luciferina	Nacalai Tesque	01493-85	Solução de estoque: 100mM em solução salina a 0,9%
DNase	Worthington Biochemical Corporation	LK003172	Solução de estoque: 1000U/ml em EBSS
EBSS Worthington	Biochemical Corporation	LK003188
Prato de fundo de vidro	IWAKI	3910-035
Suplemento de N2 (100x)	invitrogen	17502-048
N-acetil-cisteína	Sigma	A-9165-25G
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LK003178	Solução de estoque: 7U/ml em EBSS
Penicilina/Streptmycine	Nacalai Tesque	09367-34
Poli-L-lisina	Sigma	P-6281	40 mg/ml em DW
Preparações para electroporação in utero
seringa de 50 ml	TERUMO	181228T
Eléctrodo	Neppagene	7-mm
Electroporator	Neppagene	CUY21 EDIT
Fórceps
Gazes	Kawamoto co.	7161
Micro capilar	Fabricado internamente
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
Pentbarbital	Kyoritsuseiyaku	Somnopentyl
Pinça
Tesoura, Micro tesoura Agulha
sutura	Akiyama MEDICAL MFG. CO	F17-40B2
Xylazine	Bayer	Seractal
Preparações para cultura de fatias
10 cm de plástico	Graxa	664160-013
Graxa de placa de Petri de plástico de 35 mm		627160
Inserção de cultura	Millipore	PICM01250
DMEM/F12	invitrogen	11039-021
Fetal Bovino Soro	Sigma	172012-500ML
Pinça Fina	DUMONT	INOX No.5
Fórceps
Cavalo Soro	Gibco	16050-122
Micro faca cirúrgica	Alcon	19 Gauge V-Lance
Multi-gás incubadora	Panasonic	MCO-5MUV-PJ
N2/B27 mídia	Feita internamente		ref. Cultura de dissociação NPC
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
Pinça
Tesoura, micro tesoura Tábua
de corte de borracha de silicone	Feita internamente