Imágenes de bioluminiscencia en tiempo real de la dinámica de señalización de muesca durante la neurogénesis de la murino

Summary

Células neurales del tallo/progenitor exhiben varias dinámicas de expresión de los componentes de señalización de la muesca que conducen a diferentes resultados de los eventos celulares. Dicha expresión dinámica puede revelarse mediante monitoreo en tiempo real, no mediante análisis estáticos, utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia altamente sensible que permite la visualización de cambios rápidos en expresiones génicas.

Abstract

La señalización de muesca regula el mantenimiento de las células madre/progenitoras neuronales mediante interacciones células celulares. Los componentes de la señalización Notch exhiben expresión dinámica. El efector de señalización de muesca Hes1 y el ligando de muesca Delta-like1 (Dll1) se expresan de manera oscilatoria en células neurales del tallo/progenitor. Debido a que el período de la expresión oscilatoria de estos genes es muy corto (2 h), es difícil monitorear su expresión cíclica. Para examinar estos cambios rápidos en la expresión génica o la dinámica de proteínas, se requieren reporteros de respuesta rápida. Debido a su rápida cinética de maduración y alta sensibilidad, el reportero de bioluminiscencia luciferasa es adecuado para monitorear los cambios rápidos en la expresión génica en las células vivas. Usamos un reportero luciferasa desestabilizado para monitorear la actividad promotora y un reportero fusionado con luciferasa para la visualización de la dinámica de proteínas a una sola célula. Estos reporteros de bioluminiscencia muestran una rápida rotación y generan señales muy débiles; por lo tanto, hemos desarrollado un sistema de imágenes de bioluminiscencia altamente sensible para detectar señales tan débiles. Estos métodos nos permiten monitorear varias dinámicas de expresión génica en células y tejidos vivos, que son información importante para ayudar a entender los estados celulares reales.

Introduction

El cerebro de los mamíferos se compone de un gran número de varios tipos de neuronas y células gliales. Todas las células se generan a partir de células neurales madre/progenitoras (NNP), que primero proliferan para expandir sus números, luego comienzan a diferenciarse en neuronas, y finalmente dan lugar a células gliales^1,2,3,4,5. Una vez que las células se han diferenciado en neuronas, no pueden proliferar o aumentar su número, y, por lo tanto, el mantenimiento de los PNJ hasta etapas posteriores es importante. La señalización de muesca a través de interacciones célula-célula desempeña un papel importante en el mantenimiento de los PNJ^6,7. Los ligandos de muesca interactúan con la proteína de membrana, Notch, en la superficie de las células vecinas y activa la proteína Notch. Después de la activación, se produce proteólisis de la proteína Notch, liberando así el dominio intracelular de Notch (NICD) de la membrana celular en el núcleo^8,9,10. En el núcleo, NICD se une a las regiones promotoras de Hes1 y Hes5 (Hes1/5) y activa la expresión de estos genes. Hes1/5 reprime la expresión de los genes proneurales Ascl1 y Neurogenin1/2 (Neurog1/2)^11,12,13,14. Debido a que los genes proneurales inducen la diferenciación neuronal, Hes1/5 desempeña un papel esencial en el mantenimiento de los PNJ. Además, como los genes proneurales pueden activar la expresión del ligando Delatal como 1 (Dll1), Hes1/5 también reprime la expresión de Dll1. Por lo tanto, la expresión de Dll1 conduce a que las celdas vecinas sean negativas para Dll1 a través de la señalización Notch. De esta manera, las células inhiben que las células adyacentes sigan su mismo destino, un fenómeno conocido como inhibición lateral^8. En el cerebro en desarrollo, la inhibición lateral juega un papel en la generación de varios tipos de células diferentes.

La imagen en tiempo real a nivel de celda única revela expresiones dinámicas de los componentes de la señalización Notch en NPC^15,16,17. La señalización de muesca activa la expresión de Hes1,pero la proteína Hes1 se une a su propio promotor y reprime su propia expresión. Además, Hes1 es una proteína extremadamente inestable, que se degrada por la vía ubiquitina-proteasoma; por lo tanto, la represión de su propio promotor es sólo de corta duración y luego la transcripción comienza de nuevo. De esta manera, la expresión de Hes1 oscila tanto a nivel de transcripción como traslacional en un ciclo de 2 h^18. La expresión oscilatoria de Hes1, a su vez, induce la expresión oscilatoria de los genes diana aguas abajo, como Ascl1, Neurog2 y Dll1, a través de la represión periódica^15,16,17,19. Mientras que los genes proneurales pueden inducir la diferenciación neuronal, su expresión oscilatoria no es suficiente para la diferenciación neuronal; más bien su expresión sostenida es esencial para la diferenciación neuronal. La expresión oscilatoria de genes proneurales es importante para mantener los PNJ en lugar de inducir la diferenciación neuronal^14,15,16. La expresión de Dll1 oscila tanto a nivel de transcripción como traslacional durante diversas morfogénesis, como la neurogénesis y la somitogénesis. La expresión dinámica de Dll1 es importante para la morfogénesis normal y la expresión constante de Dll1 induce defectos en la neurogénesis y la somitogénesis^17. Estos hallazgos demuestran la importante función que la dinámica de la expresión génica y la cinética proteica tienen en la regulación de diversos eventos de desarrollo (es decir, diferentes dinámicas de expresión producen diferentes resultados en los comportamientos celulares).

Para analizar la dinámica de la señalización de la muesca, el análisis estático de los tejidos y las células es insuficiente porque están cambiando constantemente. La toma de imágenes en tiempo real de células individuales es una poderosa herramienta para revelar la dinámica en la expresión génica. La expresión dinámica de las moléculas de señalización de Notch sufre respuestas cíclicas rápidas en el período de 2-3 h. Esta rápida expresión periódica presenta dos problemas difíciles para el monitoreo en tiempo real: (1) la expresión de las moléculas se suprime a niveles bajos, y (2) la rotación rápida requiere reporteros de respuesta rápida. Para superar estos problemas, previamente desarrollamos un método de imagen en tiempo real de bioluminiscencia²⁰. Debido a que el reportero de bioluminiscencia tiene una mayor sensibilidad y un tiempo de maduración más corto que los reporteros fluorescentes, esta estrategia nos permite monitorear la dinámica rápida en las células vivas. Usando la visualización en tiempo real, encontramos que más genes mostraban una expresión dinámica de lo que habíamos pensado anteriormente. Además, ha aumentado el número de informes que muestran la expresión y la dinámica de proteínas en las células vivas y la importancia de estas dinámicas en diversos eventos biológicos, lo que sugiere un papel fundamental de la dinámica en las expresiones génicas^21,22.

En este informe, se describe una manera de visualizar la expresión del ligando de la muesca Dll1 en los NNJ tanto en cultivos disociados como en cultivos de sectores corticales. Para monitorear la dinámica de la transcripción de Dll1 a niveles de una sola célula, generamos cultivos disociados de PNJ derivados del telencéfalo embrionario de ratones transgénicos que transportaban a un reportero pDll1-Ub-Fluc, un reportero de luciferasa desestabilizado impulsado por el promotor de Dll1. Para monitorear la dinámica de proteínas Dll1 in vivo, introdujimos el reportero de fusión Dll1-Fluc en los PNJ en la corteza y visualizamos la expresión del reportero en los PNJ en cultivos de rebanadas corticales. Las imágenes en tiempo real nos permitieron capturar las diversas características de la expresión génica y la dinámica de proteínas en células vivas a alta resolución temporal.

Protocol

Todo el procedimiento, incluidos los sujetos de animales, ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto de Vida Fronteriza y Ciencias Médicas de la Universidad de Kioto. 1. Reporteros de bioluminiscencia NOTA: El reportero de luciferasa es adecuado para medir la dinámica rápida de la actividad promotora mediante la fusión de la señal de degradación. Además, el reportero de fusión de luciferasa permite monitorear la …

Representative Results

Las expresiones de los genes Hes1/7 exhiben ciclo de oscilación de 2 h en varias líneas celulares y durante la somitogénesis. Además, el período de oscilación es muy corto y tanto sus ARNm como sus proteínas son extremadamente inestables con la vida media de alrededor de 20 min. Si se utiliza un reportero de respuesta lenta, no podemos rastrear una dinámica tan rápida, y si se utiliza un reportero estable, se acumula gradualmente mientras la expresión génica oscila. Por lo tanto, el reportero debe ser…

Discussion

Los componentes de la señalización Notch muestran expresiones oscilatorias en sincronía durante la somitogénesis pero fuera de sincronía durante la neurogénesis, lo que lleva a las dificultades para capturar la dinámica de expresión mediante análisis estático en este último caso. Por lo tanto, se requiere monitoreo en tiempo real para revelar la dinámica de expresión de los componentes de señalización Notch, como Hes1 y Dll1. Debido a que los períodos de las expresiones de las oscilacion…

Materials

Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller)	Julabo	Model: F12-ED
Cooled CCD camera	Andor Technology	Model: iKon-M 934
Incubator system	TOKAI HIT	Model: INU-ONICS
Inverted microscope	Olympus	Model: IX81
Inverted microscope	Olympus	Model: IX83
LED illumination device	CoolLED	Model: pE1
MetaMorph	MOLECULAR DEVICES	Model: 40000
Mix gas controller	Tokken	Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens	Olympus	Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope	Nikon	Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope	Leica	Model: MZ16FA
Fine forceps	DUMONT	INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish	greiner	664160-013
35-mm plastic petri dish	greiner	627160
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
DMEM/F12	invitrogen	11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement	invitrogen	12587-010
bFGF	invitrogen	13256-029	Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin	Nacalai Tesque	01493-85	Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase	Worthington Biochemical Corporation	LK003172	Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS	Worthington Biochemical Corporation	LK003188
Glass bottom dish	IWAKI	3910-035
N2 supplement (100x)	invitrogen	17502-048
N-acetyl-cystein	Sigma	A-9165-25G
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LK003178	Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine	Nacalai Tesque	09367-34
Poly-L-lysine	Sigma	P-6281	40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe	TERUMO	181228T
Electrode	Neppagene	7-mm
Electroporator	Neppagene	CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes	Kawamoto co.	7161
Micro capillary	Made in-house
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
Pentbarbital	Kyoritsuseiyaku	Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle	Akiyama MEDICAL MFG. CO	F17-40B2
Xylazine	Bayer	Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish	greiner	664160-013
35-mm plastic petri dish	greiner	627160
Culture insert	Millipore	PICM01250
DMEM/F12	invitrogen	11039-021
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012-500ML
Fine forceps	DUMONT	INOX No.5
Forceps
Horse Serum	Gibco	16050-122
Micro surgical knife	Alcon	19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator	Panasonic	MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media	Made in-house		ref. NPC dissociatioin culture
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board	Made in-house