Real tid bioluminescence avbildning av notch signalering dynamik under Murine neurogenes
Summary
Neurala Stem/progenitorceller uppvisar olika uttrycks dynamik av notch signalering komponenter som leder till olika resultat av cellulära händelser. Sådana dynamiska uttryck kan avslöjas genom realtidsövervakning, inte av statisk analys, med hjälp av en mycket känslig Mareld Imaging system som möjliggör visualisering av snabba förändringar i genuttryck.
Abstract
Notch signalering reglerar upprätthållandet av neurala stamceller/progenitorceller av cell-cell interaktioner. Komponenterna i notch signalering uppvisar dynamiskt uttryck. Notch signalering effektor Hes1 och notch ligand delta-like1 (Dll1) uttrycks i en oscillerande sätt i neurala stamceller/progenitorceller. Eftersom perioden av oscillatoriska uttrycket av dessa gener är mycket kort (2 h), är det svårt att övervaka deras cykliska uttryck. För att undersöka sådana snabba förändringar i genuttrycket eller proteindynamiken krävs snabba responsreportrar. På grund av dess snabba mognad kinetik och hög känslighet, den Mareld reporter luciferas är lämplig för att övervaka snabba genuttryck förändringar i levande celler. Vi använde en destabiliserat luciferas reporter för övervakning av arrangören aktivitet och en luciferas-smält reporter för visualisering av proteindynamik vid enkel cells upplösning. Dessa Mareld reportrar visar snabb omsättning och genererar mycket svaga signaler; Därför har vi utvecklat en mycket känslig Mareld Imaging system för att upptäcka sådana svaga signaler. Dessa metoder gör det möjligt för oss att övervaka olika gener uttrycks dynamik i levande celler och vävnader, som är viktig information för att hjälpa till att förstå de faktiska cellulära tillstånd.
Introduction
Däggdjurs hjärnan består av ett stort antal olika typer av nervceller och gliaceller. Alla celler genereras från neurala stamceller/progenitorceller (NPCs), som först föröka sig för att utöka deras antal, sedan börja differentiera till nervceller, och slutligen ge upphov till gliaceller1,2,3,4,5. När celler har differentierat till nervceller, de kan inte föröka sig eller ökar deras antal, och, därför, underhåll av NPC tills senare stadier är viktigt. Notch signalering via cell-cell interaktioner spelar en viktig roll för att upprätthålla NPCs6,7. Notch ligander interagera med membranprotein, notch, på ytan av angränsande celler och aktiverar notch protein. Efter aktiveringen, proteolys av notch protein uppstår, därmed släppa den intracellulära domänen av notch (NiCd) från cellmembranet i Nucleus8,9,10. I kärnan binder NICD till Promotorns regioner Hes1 och Hes5 (Hes1/5) och aktiverar uttrycket för dessa gener. Hes1/5 Tryck igen uttrycket av proneural gener Ascl1 och Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Eftersom proneural gener inducerar neuronala differentiering, Hes1/5 spela viktiga roller i att upprätthålla NPC. Dessutom, som proneural gener kan aktivera uttrycket av notch ligand delta-like1 (Dll1), Hes1/5 också trycka uttrycket av Dll1. Därför, uttrycket av Dll1 leder till angränsande celler är negativa för Dll1 via notch signalering. På detta sätt, celler hämmar angränsande celler från att följa deras samma öde, ett fenomen som kallas den laterala hämning8. I hjärnans utveckling, lateral hämning spelar en roll i att generera olika olika celltyper.
Real tids avbildning på singelcellsnivå avslöjar dynamiska uttryck av komponenterna i notch signalering i NPCs15,16,17. Notch signalering aktiverar uttrycket av Hes1, men Hes1 protein binder till sin egen promotor och ÅTERTRYCKER sitt eget uttryck. Dessutom är Hes1 ett extremt instabilt protein, som bryts ned av den ubiquitin-Proteasome vägen; Därför är repressionen av dess egna tillskyndare endast kortlivad och därefter börjar transkription igen. På detta sätt, uttrycket av Hes1 oscillerar på både transkription och translationella nivåer i en 2 h cykel18. Oscillatoriska uttrycket av Hes1, i sin tur, inducerar oscillerande uttrycket av nedströms målgener, såsom Ascl1, Neurog2, och Dll1, via periodiskt förtryck15,16,17,19. Medan proneural gener kan inducera neuronala differentiering, deras oscillatoriska uttryck är inte tillräckligt för neuronala differentiering; snarare deras ihållande uttryck är avgörande för neuronala differentiering. Det oscillatoriska uttrycket av proneural gener är viktigt för att upprätthålla NPC snarare än för att inducera neuronala differentiering14,15,16. Uttrycket av Dll1 oscillerar vid både transkription och translationella nivåer under olika morfogenes, såsom neurogenes och somitogenesis. Det dynamiska uttrycket av Dll1 är viktigt för den normala morfogenes och stadigt uttryck för Dll1 inducerar defekter i neurogenes och somitogenesis17. Dessa fynd visar den viktiga funktion som dynamiken i genuttryck och proteinkinetik har på regleringen av olika utvecklings händelser (dvs., olika uttrycks dynamik producerar olika utgångar i cellulära beteenden).
För att analysera dynamiken i notch signalering, är den statiska analysen av vävnader och celler otillräckliga eftersom de ständigt förändras. Real tids avbildning av enstaka celler är ett kraftfullt verktyg för att avslöja dynamiken i genuttryck. Det dynamiska uttrycket av notch signalmolekyler genomgår snabba cykliska svar under perioden 2-3 h. Detta snabba periodiska uttryck presenterar två svåra problem för realtids övervakningen: (1) molekylernas uttryck dämpas till låga nivåer, och (2) snabb omsättning kräver snabba svars reportrar. För att övervinna dessa problem, utvecklade vi tidigare en Mareld realtid Imaging Method20. Eftersom Mareld reporter har en högre känslighet och kortare mogning tid än fluorescerande reportrar, denna strategi gör att vi kan övervaka den snabba dynamiken i levande celler. Med Realtidsvisualisering fann vi att fler gener uppvisade ett dynamiskt uttryck än vi tidigare trott. Dessutom har antalet rapporter som visar uttryck och proteindynamik i levande celler och betydelsen av dessa dynamik i olika biologiska händelser ökat, vilket tyder på en grundläggande roll för dynamiken i genuttryck21,22.
I denna rapport beskriver vi ett sätt att visualisera uttrycket av notch ligand Dll1 i NPCs i både separerade kulturer och i kortikala segment kulturer. För att övervaka dynamiken i Dll1 transkription på enstaka cell nivåer, genererade vi dissocierade kulturer av NPC som härrör från den embryonala telencephalon av transgena möss som transporterar pDll1-UB-Fluc reporter, en Dll1 promotor driven destabiliserat luciferas reporter. För att övervaka Dll1 proteindynamik in vivo introducerade vi Dll1-Fluc fusion reporter i NPCs i cortex och visualiserade uttrycket av reportern i NPCs i kortikala segment kulturer. Real tid Imaging gjorde det möjligt för oss att fånga de olika funktionerna i genuttryck och proteindynamik i levande celler vid hög temporala upplösning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Komponenterna i notch signalering visar oscillatoriska uttryck i Synchrony under somitogenesis men av Synchrony under neurogenes, vilket leder till svårigheterna att fånga uttrycket dynamik genom statisk analys i det senare fallet. Sålunda, realtid övervakning krävs för att avslöja uttrycket dynamik av notch signalering komponenter, såsom Hes1 och Dll1. Eftersom perioderna av uttrycken för Hes1 och Dll1 svängningar är extremt korta, är cirka 2-3 h, snabb respons och instabi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Yumiko Iwamoto för att stödja produktionen av videon. Vi är också tacksamma för att Akihiro Isomura för diskussion och stöd för bildanalys, Hitoshi Miyachi för tekniska stöd för generering av transgena djur, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus medicinsk vetenskap), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) och OUIN kunitaki (Andor Japan) för teknisk support och diskussioner om Mareld Imaging system. Detta arbete stöddes av kärnforskning för Evolutionell vetenskap och teknik (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning om innovativa områden (MEXT 24116705 för H.S. och MEXT 16H06480 för R.K.), Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. och H.S.), och plattform för dynamiska förhållningssätt till levande system från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik, Japan.
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
Referências
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
- Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
- Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
- Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
- Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
- Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
- Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
- Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
- Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
- Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
- Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
- Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).
