Colección de regiones cerebrales de roedores congelados para análisis posteriores
Summary
Este procedimiento describe la recolección de regiones cerebrales congeladas discretas para obtener proteínas y ARN de alta calidad utilizando herramientas baratas y comúnmente disponibles.
Abstract
A medida que nuestra comprensión de la neurobiología ha progresado, los análisis moleculares a menudo se realizan en pequeñas áreas cerebrales como la corteza prefrontal medial (mPFC) o núcleo accumbens. El reto de este trabajo es diseccionar el área correcta preservando al mismo tiempo el microambiente a examinar. En este artículo, describimos un método simple y de bajo costo utilizando recursos disponibles en la mayoría de los laboratorios. Este método preserva el ácido nucleico y las proteínas manteniendo el tejido congelado durante todo el proceso. Los cerebros se cortan en secciones de 0,5-1,0 mm usando una matriz cerebral y dispuestos en una placa de vidrio congelado. Las marcas de interés dentro de cada sección se comparan con una referencia, como el Allen Mouse Brain Atlas, y las regiones se diseccionan usando un bisturí frío o un punzón de biopsia. A continuación, el tejido se almacena a -80 oC hasta su uso. A través de este proceso mPFC de rata y ratón, núcleo accumbens, hipocampo dorsal y ventral y otras regiones se han analizado con éxito utilizando qRT-PCR y ensayos occidentales. Este método se limita a las regiones cerebrales que se pueden identificar por puntos de referencia claros.
Introduction
Este trabajo ilustra la disección de regiones cerebrales congeladas para la extracción de ácido nucleico o proteína de alta calidad utilizando una referencia, como el Allen Mouse Brain Atlas1, como guía. En esta técnica, los cerebros se congelan con flash y se almacenan a -80 oC para su posterior seccionamiento y disección mientras se mantienen en una condición congelada. Este proceso permite al investigador cosechar un gran número de cerebros en una sesión y luego diseccionarlos para una colección precisa de múltiples regiones cerebrales.
La recopilación precisa de regiones cerebrales de interés (ROI) a menudo es necesaria al responder preguntas relacionadas con la expresión de genes y proteínas. Mientras que la farmacología, electrofisiología y optogenética se pueden utilizar en roedores de tipo salvaje o modificados genéticamente para ayudar a dilucidar los cambios moleculares que sustentan los comportamientos observados2,3,4, la medición de los cambios inducidos en transcriptomes y proteomes se utiliza a menudo para apoyar estos hallazgos. Técnicas como la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR), la hincha occidental, el RNAseq5,el MAPSeq6 y el HPLC7 son robustos y relativamente bajos en costo, lo que permite a muchos laboratorios estudiar los cambios moleculares inducidos dentro de las regiones cerebrales pequeñas2,,4,5,6.
Hay varias maneras de extraer y purificar el ácido nucleico o proteína de las regiones cerebrales8,9,10,11,12. Muchos laboratorios cosechan regiones cerebrales enfriando y cortando cerebros en hielo en el momento de la cosecha9,13. Si bien este enfoque puede dar lugar a ácido nucleico y proteína de alta calidad, es algo limitado en el tiempo, ya que la degradación dentro del microambiente del tejido puede tener lugar a estas temperaturas. Esto puede ser particularmente cierto cuando se intenta diseccionar un gran número de animales o IRO en una sola sesión. Mantener las muestras congeladas ayuda a mantener las moléculas diana lábiles mientras que proporciona al investigador tiempo para comparar cuidadosamente puntos de referencia en ambos lados de cada sección en el esfuerzo por recoger muestras relativamente puras. La captura láser es otra forma de recolectar tejido para el análisis de ARN o proteínas de las áreas cerebrales10. Este procedimiento es superior a la disección mecánica en el que se pueden identificar y aislar ROI muy pequeños y de forma irregular. Sin embargo, la captura láser está limitada por el uso de costosos equipos y reactivos, consume mucho tiempo y también puede ser más susceptible a la degradación de la muestra.
La disección de micropundado en tejidos congelados no es nueva. Los primeros trabajos de Miklos Palkovits y otros describen las técnicas básicas en detalle14,15. Esta presentación sigue en gran medida el trabajo original, con algunas mejoras para facilitar la eficiencia y disminuir el gasto del equipo necesario. Por ejemplo, las secciones cerebrales se hacen en un bloqueo cerebral congelado en lugar de en un criostato. Esto produce secciones más gruesas que reduce el número de secciones necesarias para recoger muestras de ROI. Este método también disecciona muestras en una placa de vidrio congelado que se sienta en hielo seco dentro de una caja aislada. Esto produce una etapa de subcongelación en el banco en el que trabajar. Las secciones diseccionadas de esta manera son fácilmente manipulables, lo que permite al investigador comparar ambos lados de cada sección con una referencia con el fin de limitar la contaminación de regiones fuera del ROI deseado.
Las ventajas de este protocolo son que 1) el cerebro se mantiene en una condición congelada durante todo el proceso, lo que ayuda a preservar la proteína y el ácido nucleico y da al investigador tiempo para cosechar cuidadosamente los IRO, y 2) los reactivos requeridos son baratos y se encuentran en la mayoría de los laboratorios de biología molecular. En este proceso, los cerebros enteros se seccionan a 0.5–1.0 mm en una matriz cerebral y se colocan en una placa de vidrio congelado que se enfría continuamente con hielo seco. Los lugares de interés que se encuentran en el Allen Brain Atlas1 u otros atlas cerebrales16,17 se utilizan para identificar las regiones de interés, que luego se diseccionan usando un puñetazo frío o un bisturí. Debido a que el tejido nunca se descongela, las regiones cosechadas de esta manera proporcionan ARN y proteínades de alta calidad para análisis posteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo describe una técnica para aislar pequeñas regiones específicas del cerebro mientras limita la degradación del ácido nucleico y la proteína. El daño a los tejidos cerebrales ocurre rápidamente una vez que un organismo muere. Esto se debe en parte a una rápida acumulación de glutamato extracelular y la excitotoxicidad resultante que se produce21. El ARN mensajero es particularmente vulnerable a la degradación22,23. La…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los NIH, DA043982 y DA046196.
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
Referências
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