כאן אנו מתארים שיטה אמינה למדוד מסה מיטוכונדריאלי פוטנציאל קרום בתאי גזע vivo המטפאות לשעבר תאים T.
איזון נאה של שקט, התחדשות עצמית, ובידול הוא המפתח כדי לשמר את תא גזע המטבית (HSC) הבריכה ולשמור על ייצור לכל החיים של כדוריות הדם הבוגרות. בשנים האחרונות מטבוליזם הסלולר התפתחה כרגולטור המכריע של הפונקציה HSC והגורל. בעבר הדגמנו כי אפנון של מטבוליזם מיטוכונדריאלי השפעות הגורל HSC. באופן ספציפי, על ידי ביטול צימוד כימית שרשרת התחבורה אלקטרון הצלחנו לשמור על תפקוד HSC בתנאי התרבות, כי בדרך כלל לגרום בידול מהיר. עם זאת, הגבלת מספרי hsc לעתים קרובות מונע את השימוש בבחני למדוד את מטבוליזם hsc ולכן לחזות את תפקידם. כאן, אנו מדווחים על שיטת זרימה פשוטה cy, המאפשרת מדידה אמינה של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי מסה מיטוכונדריאלי בתאים נדירים כגון HSCs. אנו דנים בבידוד של HSCs מתוך מח עצם העכבר ומדידה של מסה מיטוכונדריאלי, ממברנה פוטנציאל הפוסט לשעבר vivo התרבות. כדוגמה, אנו מציגים את האפנון של פרמטרים אלה ב HSCs באמצעות טיפול עם מאפנן מטבולית. יתר על כן, אנו להאריך את היישום של מתודולוגיה זו על הגוף האנושי הנגזר דם בתאי T ואת הגידול האנושי החדירה לימפוציטים (TILs), מראה הבדלים דרמטיים פרופילים מיטוכונדריאלי שלהם, אולי המשקף תא T שונים פונקציונליות. אנו מאמינים שניתן ליישם את האפשרות הזאת בהקרנות כדי לזהות מודולטורים של חילוף חומרים מיטוכונדריאלי בסוגי תאים שונים בהקשרים שונים.
תאי גזע המטפאות (HSCs) הם אוכלוסייה קטנה של תאים המתגוררים במח העצם להבטיח ייצור דם הומאוסטזיס במהלך חייו של אורגניזם. HSCs מתווך תהליך זה על ידי מתן ושלתי כי בתורו לייצר סופני הבדיל תאי דם בוגרים באמצעות מספר סיבובים של החטיבה התא ו מאורגן היטב שלבים1. חשוב מכך, HSCs לייצר את האנרגיה שלהם באמצעות גליקוליזיס אנאירובית. לעומת זאת, מחויבים יותר פעיל המטפאות ושלתי להחליף את חילוף החומרים שלהם לכיוון חילוף החומרים מיטוכונדריאלי2,3,4. מצב זה מטבולית ברורים הוא האמין להגן על HSCs מפני נזק הסלולר שנגרמו על ידי מינים חמצן תגובתי (ROS) המיוצר על ידי active מיטוa, ובכך שמירה על הטווח הארוך שלהם בפונקציה vivo5,6,7,8. מדידה ישירה של מצב מטבולית HSC היא מאתגרת ולעתים קרובות תפוקה נמוכה בשל המספרים המוגבלים שלהם. כאן, אנו מתארים שיטת הזרימה cy, מבוסס על מדידה חזקה של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) באמצעות מתיל הטטרמתיל (TMRM) ניאון, ומסה מיטוכונדריאלי באמצעות כתם ירוק מיטוכונדריאלי ירוקה (Mitotracker גרין) ב HSCs. הדגמנו בעבר כי נמוך ΔΨm הוא סמן פונקציונלי בתום-בלבד של מטוהרים מאוד HSCs9 ו מודולים מטבולית מסוגל להוריד ΔΨm לשפר HSCs פונקציה9,10. כאן אנו מציעים להשתמש בשיטה שלנו על HSCs פרופיל מיטוכונדריאלי כמו אסטרטגיה כדי לזהות מולקולות הרומן מסוגל לשפר את הפוטנציאל לטווח ארוך של HSCs דם מחדש.
לדוגמה, אנו מדגימים כי האפשרות הזו מודדת באופן אמין את הורדת HSC ΔΨm בעת החשיפה לויטמין B3 באמצעות הריבוסייד (NR). לפיכך, במחקר שפורסם לאחרונה שלנו אנו מדגימים כי ע”נ בחוזקה התאוששות ההתאוששות דם בשני העכבר ההומניסטיים מערכות העכבר על ידי שיפור ישיר גזע המטתית ופונקציות מחולל הקדמון10. הקיבולת של מודולטורים כגון זה הוא בעל ערך קליני גדול בהתחשב בכך 25% שיעור התמותה מקושר לעיכוב בדם והתאוששות החיסונית בחולים מושתלים11,12.
יתר על כן, אנו מספקים ראיות כי מתודולוגיה זו ניתן להחיל על האפיון של פרופיל חילוף החומרים ותפקוד של תאי T האדם. בשנים האחרונות, התפתחות של טיפול בתאים המאמצת (ACT) באמצעות גידול אוטוולוגי החדירה לימפוציטים (TILs) הפך את הגישה היעילה ביותר עבור סוגים מסוימים של סרטן מתקדם עם פרוגנוזה שלילי מאוד (למשל, מלנומה גרורתית, שם > 50% של חולים להגיב לטיפול עד 24% מהחולים יש רגרסיה מלאה)13 עם זאת, TILs מחסה פעילות אנטי סרטניים מספיק קשה ליצור14. התפשטות נרחבת וגירוי כי TILs לעבור במהלך הרחבת לשעבר vivo לגרום לתשישות תא T והזדקנות כי לפגוע באופן דרמטי התגובה תא אנטי הגידול15. חשוב מכך, הקיבולת האנטי מוסרית TILs מקושרת הדוק לחילוף החומרים שלהם16,17 וגישות שמטרתן לווסת את חילוף החומרים באמצעות עיכוב של מסלול PI3K/akt הפיק לעודד תוצאות18,19. מסיבה זו, אנו משווים את ΔΨm של תאים שמקורם בתאי דם היקפיים מוניונקה (PBMCs) ואת החולה נגזר TILs, ולהראות כי הבדיל פחות PBMC-נגזר בתאי T יש ΔΨm נמוך יותר מסה מיטוכונדריאלי לעומת TILs הבדיל סופני.
אנו מסוגלים לדמיין שניתן להשתמש בתיקון זה כדי לזהות מאפטורים מטבולית חדשניים המשפרים את פונקציית התאים HSC ו-T באמצעות האפנון של ΔΨm.
התקנה הדוקה של הפונקציה HSC חשוב לשמור על המטפיאה יציבה במהלך חייו של אורגניזם. כמו סוגים שונים של תאים אחרים בגוף, רכיב מפתח שתורם לוויסות הפונקציה HSC הוא חילוף החומרים הסלולר. מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו9 ואחרים 2,3 יש מעורבים את החשיבות שלהמיטומטר</s…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לזרם UNIL Flow מתקן ליבה על תמיכתם במיוחד ד ר רומן Bedel. עבודה זו נתמכת על-ידי מלגת הקרן של כריסטיאן גרהרד בגין נ. ב. וO.N.
5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |