फ्लो साइटोमेट्री द्वारा हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और टी-सेल में माइटोकॉन्ड्रियल मास और झिल्ली क्षमता का मापन
Summary
यहां हम पूर्व वीवो सुसंस्कृत हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और झिल्ली क्षमता को मापने के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
quiescence, आत्म नवीकरण, और भेदभाव का एक अच्छा संतुलन हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) पूल को संरक्षित करने और सभी परिपक्व रक्त कोशिकाओं के आजीवन उत्पादन को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । हाल के वर्षों में सेलुलर चयापचय एचएससी समारोह और भाग्य के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में उभरा है । हमने पहले यह दर्शाया है कि माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म का मॉड्यूलेशन एचएससी भाग्य को प्रभावित करता है। विशेष रूप से, रासायनिक रूप से इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला को अनकपलिंग करके हम संस्कृति की स्थिति में एचएससी फ़ंक्शन को बनाए रखने में सक्षम थे जो आम तौर पर तेजी से भेदभाव को प्रेरित करते हैं। हालांकि, एचएससी संख्या सीमित अक्सर एचएससी चयापचय को मापने के लिए मानक परख के उपयोग को रोकना और इसलिए उनके समारोह की भविष्यवाणी । यहां, हम एक साधारण प्रवाह साइटोमेट्री परख की रिपोर्ट करते हैं जो एचएससी जैसी दुर्लभ कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान के विश्वसनीय माप की अनुमति देता है। हम माउस बोन मैरो से एचएससी के अलगाव और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और झिल्ली संभावित पोस्ट पूर्व वीवो संस्कृति के माप पर चर्चा करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम एक मेटाबोलिक मॉड्यूलर के साथ उपचार के माध्यम से एचएससी में इन मापदंडों का मॉड्यूलेशन दिखाते हैं। इसके अलावा, हम मानव परिधीय रक्त-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं और मानव ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइट्स (TILs) पर इस पद्धति के आवेदन का विस्तार करते हैं, जो उनके माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइल में नाटकीय अंतर दिखाते हैं, संभवतः विभिन्न टी सेल को दर्शाती है कार्यक्षमता. हमारा मानना है कि इस परख को विभिन्न संदर्भों में विभिन्न सेल प्रकारों में माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म के मॉड्यूलर की पहचान करने के लिए स्क्रीनिंग में नियोजित किया जा सकता है।
Introduction
हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) अस्थि मज्जा में रहने वाली कोशिकाओं की एक छोटी आबादी है जो एक जीव के जीवनकाल में रक्त उत्पादन और होमोस्टोसिस सुनिश्चित करती है। एचएससी ने इस प्रक्रिया को जनकों को जन्म देकर मध्यस्थता की कि बदले में सेल डिवीजन के कई दौरों और अच्छी तरह से करवाया भेदभाव कदम1के माध्यम से मरणासन्न विभेदित परिपक्व रक्त कोशिका वंश का उत्पादन । महत्वपूर्ण बात, एचएससी एनारोबिक ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से अपनी ऊर्जा का उत्पादन करते हैं। इसके विपरीत, अधिक प्रतिबद्ध और सक्रिय हेमेटोपोइटिक जनक अपने चयापचय को माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म2,3,4की ओर स्विच करते हैं। माना जाता है कि यह अलग मेटाबोलिक राज्य एचएससी को सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा उत्पादित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) द्वारा दिए गए सेलुलर नुकसान से बचाता है, जिससे वीवो फ़ंक्शन5,6,7,8में उनकी दीर्घकालिक अवधि को बनाए रखा जाता है। एचएससी मेटाबोलिक राज्य का प्रत्यक्ष माप चुनौतीपूर्ण है और अक्सर उनकी सीमित संख्या के कारण कम थ्रूपुट होता है। यहां, हम एचएससी में हरे फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग (माइटोट्रैकर ग्रीन) का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (टीएमआरएम) फ्लोरेसेंस का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (टीएमआरएम) फ्लोरेसेंस के मजबूत माप नप के लिए प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित परख का वर्णन करते हैं। हमने पहले यह दर्शाया है कि कम शुद्ध एचएससी9 और मेटाबोलिक मॉड्यूलर का एक सदाशयी कार्यात्मक मार्कर है जो एचएससी कार्य9,10को कम करने में सक्षम है। यहां हम एचएससी की दीर्घकालिक रक्त पुनर्गठन क्षमता में सुधार करने में सक्षम उपन्यास अणुओं की पहचान करने के लिए रणनीति के रूप में एचएससी माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइलिंग पर अपनी विधि के उपयोग का प्रस्ताव करते हैं ।
एक उदाहरण के रूप में, हम प्रदर्शित करते हैं कि यह परख विटामिन बी 3 एनालॉग निकोटिनमाइड राइबोसाइड (एनआर) के संपर्क में आने पर एचएससी को कम करने के लिए मज़बूती से मापता है। तदनुसार, हमारे हाल ही में प्रकाशित अध्ययन में हम प्रदर्शित करते हैं कि एनआर सीधे हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनककार्यों 10में सुधार करके माउस और मानवीकृत माउस सिस्टम दोनों में रक्त वसूली पोस्टट्रांसप्लांट में सुधार करता है। इस तरह के मेटाबोलिक मॉड्यूलर की क्षमता महान नैदानिक मूल्य की है , यह देखते हुए कि 25% मृत्यु दर11,12के बाद के रोगियों में रक्त और प्रतिरक्षा वसूली में देरी से जुड़ी हुई है ।
इसके अलावा, हम सबूत प्रदान करते हैं कि इस पद्धति को मेटाबोलिक प्रोफाइल और मानव टी कोशिकाओं के कार्य के लक्षण वर्णन के लिए लागू किया जा सकता है। हाल के वर्षों में, ऑटोलोगस ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइट्स (TILs) का उपयोग करके दत्तक सेल थेरेपी (अधिनियम) का विकास बेहद प्रतिकूल पूर्वानुमान (जैसे, मेटास्टैटिक मेलानोमा, जहां और 50% रोगियों के उपचार का जवाब देते हैं)13के साथ कुछ प्रकार के उन्नत कैंसर के लिए सबसे प्रभावी दृष्टिकोण बन गया है। हालांकि, पर्याप्त एंटीट्यूमर गतिविधि को शरण देने वाले टीआईएलएसको 14उत्पन्न करना मुश्किल है। पूर्व वीवो विस्तार के दौरान टीआईएल द्वारा किए जाने वाले व्यापक प्रसार और उत्तेजना के कारण टी सेल थकावट और सेनेसेंस होता है जो नाटकीय रूप से टी सेल एंटीट्यूमर प्रतिक्रिया15को ख़राब करता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि टीआईएलएस की एंटीट्यूमरल क्षमता उनके मेटाबोलिज्म16,17 से कसकर जुड़ी हुई है और PI3K/Akt मार्ग के अवरोध के माध्यम से चयापचय को मिलाने के उद्देश्य से दृष्टिकोण ने उत्साहजनक परिणाम18,19का उत्पादन किया है । इस कारण से, हम परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) और रोगी-व्युत्पन्न टीएलएस से प्राप्त टी कोशिकाओं की तुलना करते हैं, और बताते हैं कि कम विभेदित पीबीएमसी-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में मरणासन्न विभेदित टीआईएल की तुलना में कम और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान होता है।
हम कल्पना करते हैं कि इस परख का उपयोग उपन्यास मेटाबोलिक मॉड्यूलर्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो एचएससी और टी सेल फ़ंक्शन को बेहतर बनाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीव के जीवनकाल के दौरान स्थिर हेमेटोपोइसिस को बनाए रखने के लिए एचएससी फ़ंक्शन का एक तंग विनियमन महत्वपूर्ण है। शरीर में विभिन्न अन्य सेल प्रकारों की तरह, एचएससी फ़ंक्शन के नियमन में योगदान देने वाला ए…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके समर्थन के लिए यूनिल फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा विशेष रूप से डॉ रोमेन बेडेल का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को क्रिस्टियन गेरहार्ड जेबसेन फाउंडेशन ग्रांट ने एनवी और ओएन को सपोर्ट किया था ।
Materials
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
Referências
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