유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정
Summary
여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.
Abstract
정지, 자기 재생 및 분화의 미세 한 균형은 조혈 줄기 세포를 보존하는 열쇠 (HSC) 풀과 모든 성숙한 혈액 세포의 평생 생산을 유지. 최근 몇 년 동안 세포 대사HSC 기능과 운명의 중요 한 레 귤 레이 트로 등장 했다. 우리는 이전에 미토콘드리아 대사의 변조가 HSC 운명에 영향을 미친다는 것을 입증했습니다. 특히, 전자 수송 사슬을 화학적으로 분리함으로써 우리는 일반적으로 급속한 분화를 유도하는 배양 조건에서 HSC 기능을 유지할 수 있었습니다. 그러나, HSC 수를 제한하는 것은 수시로 HSC 물질 대사를 측정하고 그러므로 그들의 기능을 예측하기 위하여 표준 측정법의 사용을 배제합니다. 여기에서, 우리는 HSC와 같은 희소한 세포에 있는 미토콘드리아 막 전위 그리고 미토콘드리아 질량의 믿을 수 있는 측정을 허용하는 간단한 교류 세포 분석분석서를 보고합니다. 우리는 마우스 골수에서 HSC의 격리 및 미토 콘 드리 아 질량 및 막 잠재적인 포스트 생체 배양의 측정을 논의. 예를 들어, 우리는 대사 변조기로 치료를 통해 HSC에서 이러한 매개 변수의 변조를 보여줍니다. 더욱이, 우리는 인간 말초 혈액 유래 T 세포 및 인간 종양침투 림프구 (TILs)에 이 방법의 응용 프로그램을 확장하여 미토콘드리아 프로필에 극적인 차이를 보이며 아마도 다른 T 세포를 반영합니다. 기능. 우리는 이 분석이 다른 문맥에 있는 각종 세포 모형에 있는 미토콘드리아 물질 대사의 변조기를 확인하기 위하여 검열에서 채택될 수 있다는 것을 믿습니다.
Introduction
조혈 줄기 세포 (HSCs)는 유기체의 일생 내내 혈액 생산 및 항상성을 지키는 골수에 거주하는 세포의 작은 인구입니다. HSCs는 세포 분열및 잘 조율된 분화 단계1을통해 말단분화 된 성숙한 혈액 세포 혈통을 생성하는 선조를 초래함으로써 이러한 과정을 중재한다. 중요한 것은, HSC는 혐기성 glycolysis를 통해 그들의 에너지를 생성합니다. 대조적으로, 더 헌신적이고 적극적인 조혈 선조는 미토콘드리아 물질 대사를 향해 그들의 신진 대사를 전환2,3,4. 이러한 뚜렷한 대사 상태는 활성 미토콘드리아에 의해 생성된 반응성 산소 종(ROS)에 의해 가해지는 세포 손상으로부터 HSC를 보호하는 것으로 여겨지며, 이에 따라 생체 내에서 장기간 의 기능5,6,7,8을유지한다. HSC 대사 상태의 직접 측정은 그들의 제한된 수로 인해 도전적이고 종종 낮은 처리량입니다. 여기서, 우리는 HSCs에서 녹색 형광 미토콘드리아 스테인(Mitotracker Green)을 이용한 테트라메틸호다민 메틸 에스테르(TMRM) 형광 및 미토콘드리아 질량을 이용한 미토콘드리아 막 전위(ΔΘm)의 강력한 측정을 위한 유세포분석기반 분석기를 기술한다. 우리는 이전에 낮은 ΔΔm이 고도로 정제 된 HSCs9및 ΔΘm을 낮출 수있는 대사 변조기의 보나 – 선의 기능 마커가 HSC 기능9,10을향상시키는 것을 입증했습니다. 여기에서 우리는 HSC의 장기 혈액 재구성 잠재력을 향상할 수 있는 새로운 분자를 확인하기 위한 전략으로 HSCs 미토콘드리아 프로파일링에 대한 우리의 방법을 제안합니다.
일례로, 우리는 이 분석이 비타민 B3 아날로그 니코틴아미드 리보사이드(NR)에 노출될 때 HSC ΔΘm의 하강을 안정적으로 측정한다는 것을 입증한다. 따라서, 최근 발표된 연구에서 NR은 조혈줄기 및 전구 기능을 직접 개선하여 마우스 및 인간화된 마우스 시스템 모두에서 혈액 회복 후 이식을 강력하게 개량한다는 것을 입증한다10. 이러한 대사 조절제의 용량은 이식 후 환자에서 25%의 사망률이 혈액 및 면역 회복의 지연과 관련이 있다는 점을 고려할 때 임상적 가치가크다(11,12).
더욱이, 우리는 이 방법론이 인간 T 세포의 신진 대사 단면도 및 기능의 특성화를 위해 적용될 수 있다는 증거를 제공합니다. 최근 몇 년 동안, 자가 종양 침윤 림프구 (TILs)를 이용한 입양 세포 치료 (ACT)의 개발은 매우 불리한 예후를 가진 특정 유형의 고급 암에 가장 효과적인 접근법이되었습니다 (예를 들어, 전이성 흑색종, 환자의 >50 %가 치료에 반응하고 환자의 최대 24 %가 완전한 회귀를 가지고있습니다). 그러나, 충분한 항종양 활성을 수용하는 TILs는14를생성하기 어렵다. EX 생체 확장 동안 TIL이 겪는 광범위한 증식 및 자극은 T 세포 항종양 반응을 극적으로 손상시키는 T 세포 고갈 및 노화를 야기한다15. 중요한 것은, TILs의 항종양 용량은 그들의 신진대사에 밀접하게 연결되어있으며, 17및 PI3K/Akt 통로의 억제를 통해 신진대사를 조절하기 위한 접근법은 고무적인 결과를18,19로생성했다. 이러한 이유로, 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 환자 유래 TiLs에서 파생 된 T 세포의 ΔΘm을 비교하고, 덜 분화 된 PBMC 유래 T 세포가 말기 분화 된 TiLs에 비해 더 낮은 ΔΔ및 미토콘드리아 질량을 가지고 있음을 보여줍니다.
우리는 이 분석이 ΔΘm의 변조를 통해 HSC와 T 세포 기능을 향상시키는 새로운 대사 조절기를 식별하는 데 사용될 수 있다는 것을 구상합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
HSC 기능의 엄격한 조절은 유기체의 일생 동안 안정적인 조혈을 유지하는 것이 중요합니다. 본문에 다양 한 다른 세포 유형 처럼, HSC 기능의 조절에 기여 하는 주요 구성 요소는 세포 대사. 우리의 실험실에서 이전 연구9 그리고 다른사람 2,3 HSC에서 뚜렷한 대사 상태를 유지에 미토 콘 드리 아의 중요성을 연루 했다. murine 골수에서 분리 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 UNIL 흐름 세포 분석 코어 시설의 지원에 특히 로메인 베델 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 N.V와 O.N.에 크리스티안 게르하르트 제브슨 재단 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
Referências
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