Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

Resumo

Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.

Resumo

Um bom equilíbrio de quiescência, auto-renovação e diferenciação é fundamental para preservar a piscina de células-tronco hematopoiéticas (HSC) e manter a produção ao longo da vida de todas as células sanguíneas maduras. Nos últimos anos, o metabolismo celular emergiu como um regulador crucial da função hsc e destino. Nós demonstramos previamente que a modulação do metabolismo mitocondrial influencia o destino de HSC. Especificamente, ao desacoplado quimicamente a cadeia de transporte de elétrons, fomos capazes de manter a função HSC em condições culturais que normalmente induzem a diferenciação rápida. No entanto, limitar os números do HSC muitas vezes impede o uso de ensaios padrão para medir o metabolismo do HSC e, portanto, prever sua função. Aqui, relatamos um ensaio de citometria de fluxo simples que permite a medição confiável do potencial da membrana mitocondrial e massa mitocondrial em células escassas, como HSCs. Discutimos o isolamento de HSCs da medula óssea do rato e a medição da massa mitocondrial e da cultura pós-vivo potencial de membrana. Como exemplo, mostramos a modulação desses parâmetros em HSCs por meio de tratamento com modulador metabólico. Além disso, ampliamos a aplicação dessa metodologia sobre células T derivadas do sangue periférico humano e linfocitos infiltrados de tumores humanos (TILs), mostrando diferenças dramáticas em seus perfis mitocondriais, possivelmente refletindo diferentes células T Funcionalidade. Acreditamos que este ensaio pode ser empregado em exames para identificar moduladores do metabolismo mitocondrial em vários tipos de células em diferentes contextos.

Introdução

As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são uma pequena população de células que residem na medula óssea, garantindo a produção sanguínea e a homeostase ao longo da vida útil de um organismo. HSCs mediar este processo, dando origem a progenitores que, por sua vez, produzem linhagens de células sanguíneas maduras diferenciadas terminalmente através de várias rodadas de divisão celular e passos de diferenciação bem orquestrada¹. É importante ressaltar que os HSCs produzem sua energia através da glicolíse anaeróbica. Em contraste, progenitores hematopoiéticos mais comprometidos e ativos mudam seu metabolismo para o metabolismo mitocondrial

Protocolo

Todos os experimentos descritos no manuscrito seguem as diretrizes de nossa instituição e foram realizados de acordo com a lei suíça para experimentação animal (Autorização: VD3194) e para pesquisas envolvendo amostras humanas (Protocolo: 235/14; CER-VD 2017-00490)

1. Extração hematopoiética de células-tronco

1. Compre ratos C57BL6/J do tipo selvagem e mantenha-os na casa animal no mínimo uma semana para reduzir o esforço transporte-associado.
2. No dia do experimento, eutanásia o mouse usando asfixia CO_2.
3. Pulverizar o rato com 70% de etanol para esterilizar a pele e abrir o rato na barriga usando ferramen....

Resultados

Na Figura 1 mostramos a estratégia de gating para o isolamento das células-tronco hematopoiéticas da medula óssea do rato e o layout da placa para sua cultura ex vivo. A Figura 1A mostra a identificação da fração de linfócitos na trama do SSC-A/FSC-A. Os doublets foram removidos na porta do singlet seguida pela identificação de pilhas vivas pela ausência do sinal de DAPI. A população de LKS, definida pela linhagem- Sca1⁺cKit⁺

Discussão

Uma regulamentação rigorosa da função do HSC é importante para manter a hematopoiese estável durante a vida de um organismo. Como vários outros tipos de células no corpo, um componente-chave que contribui para a regulação da função HSC é o metabolismo celular. Estudos anteriores do nosso laboratório⁹ e outros^2,3 implicaram a importância das mitocôndrias na manutenção de um estado metabólico distinto em HSCs. Devido ao número extremamente b.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos FACS de 5 mL	Falcon	352235	Preparação de amostras
Placa inferior em 96-U	Corning	3799	Cultura de células
AutoMACS pro separador	Miltenyi Biotec		Separação automática de células
BD FACS AriaIII	Becton e Dickinson		Classificação de células
BD Kit de enriquecimento de células progenitoras hematopoiéticas de camundongo IMag	BD	558451	Depleção de linhagem
BD LSRII	Becton e Dickinson		Máquina de aquisição FACS
BD-DIVA	Becton e Dickinson		Software
de aquisição CD150 PE	Biolegend	115904	Mistura de coloração de anticorpos
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Mistura de coloração de anticorpos
CD48 PB	Biolegend	103418	Mistura de coloração de anticorpos
Centrífuga- 5810R	Eppendorf		Centrifugação
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Mistura de coloração de anticorpos
Fluxo para	FlowJo LLC		FACS Software de análise
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotagem de dados em gráficos
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Coloração mitocondrial verde-fluorescente para medir a massa mitocondrial; concentração de trabalho = 100 nM; concentração de estoque = 1 mM
Ribosídeo de Nicotinamida (NR)	Sintetizado sob medida em casa		Modulador metabólico; concentração de trabalho = 500 µ M; concentração de estoque = 50 mM
PBS	CHUV		Preparação do tampão; concentração de trabalho = 1x; concentração de estoque = 1x
Pen-Strep (P/S)Tecnologias de	vida	15140122	cultura Ex vivo; concentração de trabalho = 1x; concentração de estoque = 1x
tampão de lise de hemácias	Biolegend	420301	Lysing Glóbulos vermelhos; concentração de trabalho = 1x; concentração de estoque = 10x
Ligante Flt-3 de camundongo recombinante (FLT3)	RnD	427-FL-005 / CF	Cultura ex vivo; concentração de trabalho = 2 ng / mL; concentração de estoque = 10 µ g/mL
Fator recombinante da pilha estaminal do rato (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Cultura ex vivo; concentração de trabalho = 100 ng/mL; concentração conservada em estoque = 50 µ g / mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Mistura de coloração de anticorpos
StemlineII Meio de expansão de células-tronco hematopoiéticas	SIGMA	S0192	Cultura ex vivo
Estreptavidina Pac laranja	Life Technologies	S32365	Mistura de coloração de anticorpos
Estreptavidina Tx vermelha	Life Technologies	S872	Mistura
de coloração de anticorposTMRM	Invitrogen	T668	Potencial de coloração da membrana mitocondrial; concentração de trabalho = 200 nM; concentração de estoque = 10 mM
EDTA ultrapuro	Invitrogen	15575-038	Preparação do tampão; concentração de trabalho = 0,5 M; concentração de estoque = 1 mM

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