Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Summary

Die Proliferation von Cardiomyozyten nach einer Verletzung ist ein dynamischer Prozess, der eine Symphonie extrazellulärer Hinweise aus Nicht-Myozyten-Zellpopulationen erfordert. Mit Lineage-Tracing, passiven CLARITY und dreidimensionalen konfokalen Mikroskopie-Techniken mit ganzer Montage können wir den Einfluss einer Vielzahl von Zelltypen auf die Herzreparatur und -regeneration analysieren.

Abstract

Herz-Kreislauf-Erkrankungen übertreffen alle anderen Todesursachen und sind für unglaubliche 31 % der Todesfälle weltweit verantwortlich. Diese Krankheit manifestiert sich bei Herzverletzungen, in erster Linie in Form eines akuten Myokardinfarkts. Mit wenig Resilienz nach Verletzungen wird das einst gesunde Herzgewebe durch faseriges, nicht kontraktiles Narbengewebe ersetzt und ist oft ein Vorspiel zu Herzinsuffizienz. Um neue Behandlungsmöglichkeiten in der regenerativen Medizin zu identifizieren, konzentrierte sich die Forschung auf Wirbeltiere mit angeborenen regenerativen Fähigkeiten. Ein solcher Modellorganismus ist die Neonatalmaus, die auf Herzverletzungen mit robuster Myokardregeneration reagiert. Um eine Verletzung bei der neonatalen Maus zu induzieren, die klinisch relevant ist, haben wir eine Operation entwickelt, um die linke vordere absteigende Arterie (LAD) zu verdecken, die einen Myokardinfarkt widerspiegelt, der durch Arteriosklerose im menschlichen Herzen ausgelöst wird. In Verbindung mit der Technologie, um Veränderungen sowohl innerhalb von Kardiomyozyten als auch innerhalb von Nicht-Myozytenpopulationen zu verfolgen, bietet uns dieses Modell eine Plattform, um die Mechanismen zu identifizieren, die die Herzregeneration leiten. Einblicke in Veränderungen der Herzzellpopulationen nach Verletzungen stützten sich einst stark auf Methoden wie Gewebeschnitt und histologische Untersuchung, die sich auf zweidimensionale Analysen beschränken und dabei oft das Gewebe schädigen. Darüber hinaus ist es diesen Methoden nicht in der Lage, Veränderungen in Zelllinien nachzuverfolgen, anstatt lediglich eine Momentaufnahme der Verletzungsreaktion bereitzustellen. Hier beschreiben wir, wie technologisch fortschrittliche Methoden in Linienverfolgungsmodellen, ganzer Organreinigung und dreidimensionaler (3D) Vollmontagemikroskopie eingesetzt werden können, um Mechanismen der Herzreparatur aufzuklären. Mit unserem Protokoll für die Operation an Myokardinfarktoperationen der Neonatalen Maus, die Gewebereinigung und die 3D-Gesamteorganbildgebung können die komplexen Wege, die die Kardiomyozytenproliferation induzieren, entwirrt werden, was neue therapeutische Ziele für die Herzregeneration enthüllt.

Introduction

Das Herz gilt seit langem als ein post-mitotisches Organ, aber neuere Beweise zeigen, dass Kardiomyozyten-Erneuerung tritt im erwachsenen menschlichen Herzen bei etwa 1% pro Jahr¹. Jedoch, Diese niedrigen Raten der Kardiomyozyten Umsatz sind nicht ausreichend, um den massiven Verlust von Gewebe, die nach Verletzungen auftritt wieder aufzufüllen. Ein Herz, das einen Myokardinfarkt erlitten hat, wird etwa eine Milliarde Kardiomyozyten verlieren, die oft als Vorspiel zu Herzinsuffizienz und plötzlichem Herztod dienen^2,3. Mit über 26 Millionen Menschen, die weltweit von Herzinsuffizienz betroffen sind, besteht ein unerfüllter Bedarf an Therapeutika, die die durch Herzerkrankungen verursachten Schäden umkehren können⁴.

Um diese Lücke in der Therapeutik zu überbrücken, haben Wissenschaftler begonnen, evolutionär konservierte Mechanismen zu untersuchen, die der endogene Regeneration nach Verletzungen zugrunde liegen. Ein Modell zur Untersuchung der Herzregeneration von Säugetieren ist die Neonatalmaus. In der Woche nach der Geburt haben neonatale Mäuse eine robuste regenerative Reaktion nach Herzschäden⁵. Wir haben bereits gezeigt, dass neonatale Mäuse ihr Herz durch Kardiomyozytenproliferation nach einer apikalen Resektion^regenerierenkönnen 5 . Obwohl diese Technik die Herzregeneration bei den Neonaten hervorrufen kann, fehlt es der Operation an klinischer Relevanz für menschliche Herzverletzungen. Um eine menschliche Verletzung im neonatalen Mausmodell nachzuahmen, haben wir eine Technik entwickelt, um einen Myokardinfarkt durch einen koronaren Arterienverschluss⁶zu induzieren. Diese Technik erfordert eine chirurgische Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD), die für die Abgabe von 40%–50% des Blutes an das linksventrikuläre Myokard^6,7verantwortlich ist. So führt die Operation zu einem Infarkt, der einen erheblichen Teil der linken ventrikulären Wand trifft. Diese Schädigung des Myokards stimuliert die Kardiomyozytenproliferation und Herzregeneration bei Neonaten⁵.

Die koronare Arterienverschlusschirurgie bietet eine hochreproduzierbare und direkt translationale Methode, um das Innenleben der Herzregeneration aufzudecken. Die neonatale Chirurgie parallel koronare Arterien-Atherosklerose im menschlichen Herzen, wo Ansammlung von Plaque in den inneren Wänden der Arterien kann eine Okklusion und nachfolgenden Myokardinfarkt^{verursachen 8}. Aufgrund einer Lücke in der therapeutischen Behandlung von Herzinsuffizienz-Patienten ist ein Okklusion im LAD mit Sterblichkeitsraten verbunden, die innerhalb eines Jahres nach der Verletzung⁹bis zu 26% erreichen, und wurde daher als “Witwenmacher” bezeichnet. Fortschritte in der Therapeutik erfordern ein Modell, das die komplexen physiologischen und pathologischen Auswirkungen von Herzverletzungen genau widerspiegelt. Unser chirurgisches Protokoll für neonatale Mausherzverletzungen bietet eine Plattform, die es Forschern ermöglicht, die molekularen und zellulären Hinweise zu untersuchen, die die Herzregeneration von Säugetieren nach einer Verletzung signalisieren.

Jüngste Forschungen zeigen die dynamische Beziehung zwischen der extrazellulären Umgebung und sich ausbreitenden Kardiomyozyten. Beispielsweise kann das postnatale regenerative Fenster erweitert werden, indem die Steifigkeit der extrazellulären Matrix um das Herz¹⁰verringert wird. Biomaterialien aus der neonatalen extrazellulären Matrix können auch die Herzregeneration in erwachsenen Säugetierherzen nach einer Herzverletzung fördern¹¹. Auch die begleitende Proliferation von Kardiomyozyten ist eine angiogene Reaktion^12,13; Kollateralarterienbildung, die nur für das regenerierende Herz der Neonatalmaus einzigartig ist, erwies sich als wesentlich für die Stimulierung der Herzregeneration¹². Darüber hinaus hat unser Labor gezeigt, dass die Nervensignalisierung die Proliferation der Kardiomyozyten und die Herzregeneration durch Modulation der Wachstumsfaktorspiegel sowie die Entzündungsreaktion nach Derverletzung¹⁴reguliert. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, nicht-Myozyten-Zellpopulationen als Reaktion auf Herzverletzungen zu verfolgen. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir das Cre-lox-Rekombinationssystem in transgenen Mäuselinien genutzt, um die konstitutive oder bedingte Expression fluoreszierender Reporterproteine für die Linienverfolgung zu integrieren. Darüber hinaus können wir fortschrittliche Methoden verwenden, um die klonale Expansionsmusterung mit der Regenbogen-Mauslinie zu bestimmen, die auf der stochastischen Expression der cre-abhängigen, mehrfarbigen fluoreszierenden Reporter beruht, um die klonale Expansion von Zielzellpopulationen zu bestimmen¹⁵. Die Verwendung von Linienverfolgung enden mit der neonatalen koronaren Arterienverschlusschirurgie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die komplizierten zellulären Mechanismen der Herzregeneration zu sezieren.

Die Verfolgung der Abstammung fluoreszierend markierter Zellen mit dreidimensionaler (3D) Ganzkörperbildgebung ist mit der traditionellen Schnitt- und Rekonstruktionstechnik schwer zu erreichen – insbesondere dann, wenn Zellpopulationen zerbrechlich sind, wie Nervenfasern oder Blutgefäße. Während eine direkte Ganzkörperbildgebung des Organs durch optische Steilerstellung oberflächliche Zellpopulationen erfassen kann, bleiben Strukturen, die tief im Gewebe liegen, unzugänglich. Um diese Barrieren zu umgehen, wurden Geweberäumtechniken entwickelt, um die Opazität ganzer Organgewebe zu reduzieren. In jüngster Zeit wurden signifikante Fortschritte bei Clear Lipid-ausgetauschten Acrylamid-hybridisierten Rigid Imaging-kompatiblen Tissue hYdrogel (CLARITY)-basierten Methoden gemacht, die festes Gewebe über die Lipidextraktion¹⁶ablöschen. Es werden auch Schritte unternommen, um den Brechungsindex zu homogenisieren und anschließend die Lichtstreuung während der Bildgebung zu reduzieren¹⁷. Eine solche Methode ist die aktive CLARITY, die die Lipidzersetzung durch Elektrophorese beschleunigt, um das Waschmittel im gesamten Gewebe zu durchdringen¹⁸. Obwohl diese Geweberäummethode wirksam ist, erfordert sie teure Geräte und kann Gewebeschäden verursachen, wodurch der Ansatz mit empfindlichen Zellpopulationen wie den Herznerven 19 unvereinbar^ist. So verwenden wir den passiven CLARITY-Ansatz, der auf Wärme angewiesen ist, um das Eindringen von Reinigungsmitteln sanft zu erleichtern und so bei der Retention komplizierter Zellstrukturen zu helfen^20,21.

Passive CLARITY wird in der Regel als weniger effizient als aktive CLARITY¹⁸, da die Technik wird oft von zwei Haupthindernissen begleitet: die Unfähigkeit, die gesamte Organtiefe zu löschen und die große Menge an Zeit benötigt, um erwachsene Gewebe zu löschen. Unser passiver CLARITY-Ansatz überwindet diese beiden Barrieren mit einem beschleunigten Clearing-Prozess, der in der Lage ist, neonatales und erwachsenes Herzgewebe vollständig zu beseitigen. Unsere passive CLARITY Gewebeclearing-Technik hat eine Effizienz erreicht, die die Visualisierung einer Vielzahl von Herzzellpopulationen ermöglicht, einschließlich seltener Populationen, die im erwachsenen Herzen verteilt sind. Wenn das gelöschte Herz mit konfokaler Mikroskopie abgebildet wird, kann die Architektur der zellspezifischen Musterung während der Entwicklung, Krankheit und Regeneration beleuchtet werden.

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Guide for the Use and Care of Laboratory Animals und in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee in der School of Medicine and Public Health der University of Wisconsin-Madison durchgeführt. Alle Methoden wurden auf Wildtyp C57BL/6J (B6) und transgenen Mauslinien von Jackson Laboratories durchgeführt. 1. Koronare Arterienokklusion (Myokardinfarkt) Induziert durch Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (L…

Representative Results

Oft führen die beiden anspruchsvollsten Schritte das Herz aus der Brusthöhle und ligan den LAD. Um diese Schritte zu beheben, können Anpassungen bei der Platzierung der anfänglichen Punktion zwischen den vierten interkostalen Muskeln vorgenommen werden; Wenn die Punktion und die stumpfe Sezierung zu nah am Brustbein sind, kann das Herz die Brusthöhle möglicherweise nicht verlassen (Abbildung 1A). Zusätzlich kann ein erhöhter Druck auf den …

Discussion

Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Kardiomyozyten und Nicht-Myozytenpopulationen sind ein entscheidender Faktor dafür, ob das Herz nach verletzungen fibrosis oder repariert wird. Es wurden Entdeckungen gemacht, die zeigen, dass eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Nerven¹⁴, Epikardialzellen²⁴, Peritonealmakrophagen²⁵, Arteriole^12,13und lymphatische Endothelzellen^26…

Materials

1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8889H	Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps	Excelta	16-050-146	Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps	Fisherbrand	13-812-39	Dissecting, 4.5 in
Glass Vial	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz	Sigma-Aldrich		Density gradient medium
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors	Fisherbrand	08-951-20	Straight, 6 in
Needle Holder	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps	Excelta	16050133	Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044	Wako Chemicals		Water-soluble azo initiator