Descrevemos um sistema de cultura in vitro de matriz extracelular em 3D que permite a dissecação dos papéis da matriz e dos adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo.
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Artigo de método
Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células
Neste artigo
Resumo
Resumo
A matriz extracelular (ECM) desempenha um papel central na regulação da homeostase dos tecidos, envolvendo-se em crosstalk com as células e regulando múltiplos aspectos da função celular. O ECM desempenha um papel particularmente importante na função do tecido adiposo na obesidade, e alterações na deposição e composição de ECM do tecido adipoto estão associadas à doença metabólica em camundongos e humanos. Modelos in vitro tratáveis que permitem a dissecação dos papéis do ECM e células em contribuir para o fenótipo global de tecidos são escassos. Descrevemos um novo modelo 3D in vitro da cultura humana ECM-adipócito que permite o estudo dos papéis específicos do ECM e adipócitos na regulação do fenótipo metabólico do tecido adiposo. O tecido adiposo humano é decelularizado para isolar o ECM, que é posteriormente repovoado com preadipócitos que são então diferenciados dentro do ECM em adipócitos maduros. Este método cria construções de ECM-adipócitoque são metabolicamente ativas e retêm características dos tecidos e pacientes dos quais são derivados. Usamos este sistema para demonstrar o crosstalk ecm-adipócito específico da doença no tecido adiposo humano. Este modelo de cultura fornece uma ferramenta para dissecar os papéis do ECM e adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo global e permite o estudo do papel do ECM na regulação da homeostase do tecido adiposo.
Introdução
A matriz extracelular (ECM) não só fornece um andaime mecânico para os tecidos, mas também se envolve em crosstalk complexo com células que residem dentro dela, regulando diversos processos necessários para a homeostase de tecidos, incluindo a proliferação celular, diferenciação, sinalização e metabolismo1. Enquanto ECM saudável desempenha um papel essencial na manutenção da função normal do tecido, ECM disfuncional tem sido implicado em múltiplas doenças2.
O tecido adiposo desempenha um papel importante na patogênese da doença metabólica. A obesidade está associada à hipertrofia adipócito exc....
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Protocolo
Os tecidos adiposos são adquiridos de seres humanos submetidos a cirurgia bariátrica eletiva aprovação do conselho de revisão institucional.
1. Isolamento preadipocito e preparação de reagente cultural
- Prepare 2% de albumina séxo bovina (BSA) em solução soro sino-amortecida de fosfato 1x (PBS). Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C.
- Prepare a colagem tipo II: 2 mg/mL em 2% BSA em 1x PBS. Prepare-se imediatamente antes de usar.
- Prepare o Glóbulo Vermelho (RBC) Solução de resquação: 1,5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3,10 mM disodium EDTA em água desionizada (DI/H2O). Guarde a 4°C. Prepar....
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Resultados
A preparação do tecido adipolado ECM, a semeade com preadipócitos e a diferenciação in vitro em adipócitos maduros resultam em claras mudanças morfológicas sequenciais no tecido que permitem a avaliação visual do progresso em todo o protocolo (Figura 1) . Preadipocitos usados para semeacar o ECM são isolados usando digestão colagem de amostras separadas de IVA (Figura 2). A microscopia eletrônica de varredura de construções de EC.......
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Discussão
O modelo de cultura ECM-adipócito fornece uma ferramenta valiosa para dissecar os papéis individuais de ECM e células na dictação fenótipo de tecido final. O protocolo de isolamento de ECM é bastante reproduzível, mas a variabilidade no processo de descelularização pode ser observada. A etapa de delipiação do Dia 3 é um ponto crítico no protocolo. Na conclusão da extração durante a noite, a delipiação da matriz deve ser evidenciada pela Solução de Solvente Polar que fica amarela, enquanto a matriz deve transitar de uma c.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses conflitantes.
Agradecimentos
Agradecemos a Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa e Retha Geiss pela ajuda na coordenação do estudo. O SEM foi realizado pela Universidade de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Este projeto foi apoiado pelo NIH concede R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Piloto e Bolsa de Viabilidade do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), Pilot and Viabilidade Grant do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), Pilot and Via....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% de tripsina-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA | Cat#25200056 | |
| Tubo criovial de 1,5 mL | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EUA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µ m filtro de malha de nylon | Corning Inc., Corning, NY, EUA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| Placas de cultura de tecidos de 24 poços | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#I5879 | |
| Placas de cultura de tecidos de 96 poços | VWR International LLC., Radnor, PA, EUA | Cat#10861-666 | |
| Solução antibiótico-antimicótica (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA | Cat#15240062 | |
| Biotina | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#B4639 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EUA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Alemanha | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glicose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EUA | Cat#NET328A250UC | |
| Desoxirribonuclease I de pâncreas bovino, tipo II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#D4513 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#D4902 | |
| Dimetilsulfóxido Fisher | Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EUA | Cat#BP231 | cáustico e inflamável |
| Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EUA | Cat#BP118 | ||
| Sal hemicálcico de ácido D-pantotênico | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#21210 | |
| Dulbecco' s Meio Eagle Modificado: Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EUA | Cat#11320033 | |
| Etanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Lâminas |
| contagem de células EVE inflamáveis, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, EUA | Cat#10027-446 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldeído | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | |
| Hexametildissalizana cáustica | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#440191 | Solução inflamável e cáustica |
| de insulina humana | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EUA | Cat#A415 | |
| Isoproterenol Inflamável | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EUA | Cat#I5627 | KCl Inflamável |
| Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#S25484 | ||
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#P5655 | |
| Lipase do pâncreas suíno, tipo VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EUA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EUA | Cat#A661 | |
| Corte ideal composto de temperatura (OCT) | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, Reino Unido | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Kit de Manchas de Óleo Red-O | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, EUA | Cat#KTORO-G | |
| Tetróxido de ósmio | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#201030 | Cáustico |
| Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#93482 | |
| Solução salina tamponada com fosfato cáustico (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EUA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A do pâncreas bovino, tipo III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EUA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy MiniKit de Tecido Fibroso | Qiagen, Hilden, Alemanha | Cat#74704 | |
| Fluido de Cintilação | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EUA | Cat#SX18 | |
| Tesoura de Contador | |||
| , fórceps, tampão de fosfato estéril | |||
| de Sorensen | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| Cantil de cultura T-150 | VWR International LLC., Radnor, PA, EUA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EUA | Cat#4369016 | |
| Agitador | |||
| Homogeneizador de tecidos, BeadBug Homogeneizador de microtubos | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrina | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Kit de determinação de triglicerídeos | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Mancha azul de tripano, 0,4% | VWR International LLC., Radnor, PA, EUA | Cat#10027-446 | |
| Tipo II colagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Papel de filtro Whatman Reeve Angel, grau 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EUA | Cat#WHA5201150 |
Referências
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P.
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Reimpressões e permissões
