En mänsklig 3D extracellulär matrix-Adipocyte kultur modell för att studera Matrix-cell metabola överhörning
Summary
Vi beskriver en 3D mänskliga extracellulära matrix-adipocyte in vitro kultur system som tillåter dissektion av rollerna i matrisen och adipocyter bidra till fettvävnad metabolisk fenotyp.
Abstract
Den extracellulära matrix (ECM) spelar en central roll i regleringen av vävnad homeostas, engagera sig i överhörning med celler och reglera flera aspekter av cellulära funktion. ECM spelar en särskilt viktig roll i fettvävnad funktion i fetma, och förändringar i fettvävnad ECM deposition och sammansättning är förknippade med metabolisk sjukdom hos möss och människor. Tractable in vitro-modeller som tillåter dissektion av rollerna av ECM och celler för att bidra till den globala vävnaden fenotyp är glesa. Vi beskriver en roman 3D in vitro-modell av mänskliga ECM-adipocyte kultur som tillåter studier av de specifika rollerna för ECM och adipocyter i regleringen fettvävnad metabolisk fenotyp. Human fettvävnad är decellularized att isolera ECM, som därefter återbefolkas med Preadipocyter som sedan differentieras inom ECM till mogna adipocyter. Denna metod skapar ECM-adipocyte konstruktioner som är metaboliskt aktiva och behåller egenskaperna hos de vävnader och patienter från vilka de härleds. Vi har använt detta system för att demonstrera sjukdomsspecifik ECM-adipocyte överhörning i human fettvävnad. Denna kultur modell ger ett verktyg för dissekera rollerna för ECM och adipocyter i att bidra till globala fettvävnad metabolisk fenotyp och tillstånd studie av den roll som ECM i regleringen fettvävnad homeostas.
Introduction
Den extracellulära matrix (ECM) ger inte bara en mekanisk byggnadsställning för vävnader, men också engagerar sig i komplexa överhörning med celler som bor i den, reglerar olika processer som är nödvändiga för vävnad homeostas, inklusive cellproliferation, differentiering, signalering och metabolism1. Medan friska ECM spelar en viktig roll upprätthållandet av normal vävnad funktion, dysfunktionella ECM har varit inblandad i flera sjukdomar2.
Fettvävnad spelar en viktig roll i patogenesen av metabolisk sjukdom. Fetma är förknippad med överdriven fettceller hypertrofi och cellulära hypoxi, defekter i fettceller cellulära metabolism, och fettvävnad endoplasmatiska nätmagen och oxidativ stress och inflammation. Även dåligt förstått, dessa komplexa processer samverkar för att försämra fettvävnad näringsämnen buffring kapacitet, vilket leder till näringsämne overflow från fettvävnad, toxicitet i flera vävnader, och systemisk metabolisk sjukdom3,4 ,5. Sekvensen av händelser och specifika mekanismer som ligger bakom fettvävnad misslyckande är dåligt förstådd, men förändringar i fettvävnad ECM har varit inblandade. ECM sammansättningen ändras inom fettvävnad i human och murin fetma, med ökad deposition av ECM-protein tillsammans med kvalitativa biokemiska och strukturella skillnader i fettvävnad ECM i samband med mänsklig metabolisk sjukdom, inklusive typ 2-diabetes och hyperlipidemi6,7,8,9,10,11.
Trots dessa observationer, är den roll som fettvävnad ECM i medla fettvävnad dysfunktion inte väldefinierad. Detta är delvis på grund av en brist på tractable experimentella modeller som tillåter dissektion av de specifika rollerna av ECM och adipocyter i regleringen ultimata fettvävnad funktion. ECM-adipocyte kultur simulerar bättre in vivo miljön av infödda fettvävnad i minst två avseenden. För det första, ECM kultur ger en molekylär miljö som liknar infödda fettvävnad, inklusive infödda collagena, elastiner, och andra matris proteiner frånvarande i standard 2D-kultur. För det andra har kulturen på 2D-plast visat sig förändra fettceller metabolism via mekaniska effekter på grund av minskad elasticitet av plast substrat12, som ECM-kulturen eliminerar.
Metoder för att konstruera biologiska ställningar genom isolering av ECM från decellularized fett och andra vävnader har studerats i samband med regenerativ och rekonstruktiv medicin och vävnadsteknik13,14, 15,16,17,18. Vi har tidigare publicerat metodik där vi anpassat dessa metoder för att utveckla en in vitro-3D-modell av Human ECM-fettceller-kultur, med hjälp av ECM-och fettceller-stamceller (Preadipocyter) härledda från humana visceral fettvävnader11. I denna artikel, beskriver vi dessa metoder i detalj. Den decellularization förfarande för Human fettvävnad är en fyra dagars process som innebär mekaniska och enzymatiska behandlingar för att ta bort celler och lipid, lämnar en biologisk ställningen som upprätthåller egenskaperna hos den vävnad från vilken den härleds. Decellularized ECM stöder adipogen differentiering av humana Preadipocyter, och när de bereds med adipocyter, upprätthåller mikroarkitektur och biokemiska och sjukdomsspecifika egenskaper intakt fettvävnad och engagerar i metaboliska funktioner karakteristiska för infödda fettvävnad. Denna matris kan studeras ensamt eller reseeded med celler, tillåter studier av interaktioner och överhörning mellan cellulära och extra-cellulära komponenter av fettvävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ECM-adipocyte kultur modell ger ett värdefullt verktyg för dissekera de enskilda rollerna av ECM och celler i diktera Ultimate vävnad fenotyp. ECM isolering protokollet är ganska reproducerbar, men variationer i decellularization processen kan observeras. Dag 3 delipidation steg är en kritisk punkt i protokollet. Vid slutförandet av över natten utvinning, delipidation av matrisen bör styrkas av den polära lösningsmedels lösning svarvning gult, medan matrisen bör övergå från en gul-orange färg egenskap…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa och Retha Geiss för hjälp med studiekoordination. SEM utfördes av University of Michigan Microscopy & bildanalys laboratorium biomedicinsk forskning Core facility. Detta projekt stöddes av NIH Grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), veteraner Affairs merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot och genomförbarhets bidrag från Michigan diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veterans administration VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektronmikroskopi utförs av University of Michigan mikroskopi & bildanalys laboratorium biomedicinsk forskning Core facility. Figur 4 i detta manuskript publicerades ursprungligen i Baker et al., J Clin endo Metab 2017; 1 mars, 102 (3), 1032-1043. DOI: 10.1210/JC. 2016-2915, och har reproducerats genom tillstånd av Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. För tillstånd att återanvända detta material, vänligen besök http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
Referências
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O’Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O’Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O’Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia’s effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
