हम खरगोश कार्डियोमायोसाइट्स में GtACR1 सक्रियण के विद्युत प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम सेल अलगाव, खेती और एडेनोवायरल ट्रांसड्यूक्शन के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं, और पैच-क्लैंप और कार्बन-फाइबर तकनीकों के साथ कार्यात्मक प्रयोगों पर।
पिछले दो दशकों में, ऑप्टोजेनेटिक उपकरण दिल सहित उत्तेजनीय ऊतकों में सेल प्रकार विशिष्ट गतिविधि को मिलाने के लिए शक्तिशाली साधन के रूप में स्थापित किए गए हैं । जबकि Channelrhodopsin-2 (ChR2) कार्डियोमायोसाइट्स (मुख्यमंत्री) में झिल्ली क्षमता को ध्रुवीकृत करने के लिए एक आम उपकरण है, संभावित रूप से कार्रवाई क्षमता (एपी), सीएम गतिविधि के विश्वसनीय मुंह के लिए एक प्रभावी उपकरण गायब हो गया है। ऑप्टोजेनेटिक अवरोध के लिए एनियन चैनलोडोप्सिन (एसीआर) का उपयोग करने का सुझाव दिया गया है। यहां, हम सुसंस्कृत खरगोश सीएम में गिलार्डिया थीटा से प्राकृतिक एसीआर GtACR1 को सक्रिय करने के प्रभावों का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । प्राथमिक readouts इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और सीएम संकुचन की ऑप्टिकल ट्रैकिंग कर रहे हैं, दोनों प्रकाश उत्तेजना के विभिन्न पैटर्न लागू करते समय प्रदर्शन किया । प्रोटोकॉल में खरगोश के दिल से सीएम अलगाव, 4 दिनों तक कोशिकाओं की सीडिंग और विविधता, लाइट-गेटेड क्लोराइड चैनल के लिए एडेनोवायरस कोडिंग के माध्यम से ट्रांसड्यूक्शन, पैच-क्लैंप और कार्बन फाइबर सेटअप की तैयारी, डेटा संग्रह और विश्लेषण शामिल हैं। पूरे सेल विन्यास में पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करने से वास्तविक समय में प्रकाश-सक्रिय धाराओं (वोल्टेज-क्लैंप मोड, वी-क्लैंप) और एपी (वर्तमान-क्लैंप मोड, आई-क्लैंप) रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है। पैच-क्लैंप प्रयोगों के अलावा, हम इंट्रासेलर परिवेश को परेशान किए बिना सीएम गतिविधि के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए संकुचन मापकाजाता है। ऐसा करने के लिए, कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से कार्बन फाइबर का उपयोग करके प्रीलोडेड किया जाता है और सरकोवर लंबाई और कार्बन फाइबर दूरी में परिवर्तन ों को ट्रैक करके संकुचन दर्ज किए जाते हैं। डेटा विश्लेषण में आई-क्लैंप रिकॉर्डिंग से एपी अवधि का आकलन, वी-क्लैंप रिकॉर्डिंग से पीक धाराएं और कार्बन फाइबर मापन से बल गणना शामिल है। वर्णित प्रोटोकॉल को सीएम गतिविधि पर विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक एक्टुएटर के जैव भौतिक प्रभावों के परीक्षण के लिए लागू किया जा सकता है, जो हृदय ऊतक और पूरे दिलों में ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों की मशीनी समझ के विकास के लिए एक शर्त है।
सीएचआर-मध्यस्थता वाले फोटोकरंट्स को पहली बार यूनिकोशिलर ग्रीन शैवाल1,2के आईस्पॉट में दर्ज किया गया था । क्लैमाइडोमोनास रेनहार्ड्टी सीआर 1 और ChR2 की आनुवंशिक क्लोनिंग और हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति के तुरंत बाद, सीएचआर का उपयोग प्रकाश3,4द्वारा ज़ेनोपस ओसाइट्स और स्तनधारी कोशिकाओं में झिल्ली क्षमता को बदलने के लिए उपकरण के रूप में किया गया था। सेशन गैर-चयनात्मक सीएचआर कोशिकाओं की झिल्ली को आराम झिल्ली क्षमता के साथ डिपोलर करता है जो सीएचआर की उलटी क्षमता के लिए नकारात्मक है। इस प्रकार उनका उपयोग न्यूरॉन्स और सीएम सहित उत्तेजनीय कोशिकाओं में एपी को प्रकाश में लाने के लिए किया जा सकता है, जिससे ऑप्टिकल पेसिंग5,6की अनुमति मिल सकती है।
सीएचआर, लाइट-ड्रिवेन प्रोटॉन, क्लोराइड और सोडियम पंप7,8,9 के पूरक का उपयोग न्यूरोनल गतिविधि10,11,12को बाधित करने के लिए किया गया है। हालांकि, बाद की सीमाएं होती हैं, उच्च प्रकाश तीव्रता और निरंतर रोशनी की आवश्यकता होती है, क्योंकि एक आयन अवशोषित फोटॉन के अनुसार ले जाया जाता है। 2014 में, Wietek एट अल और Berndt एट अल द्वारा दो स्वतंत्र अध्ययनों ने चैनल पोर13,14में म्यूटेशन के माध्यम से एसीआर में सीएचआर का संचालन करने वाले सीएचआर को बदलने का वर्णन किया। एक साल बाद क्रिप्टोफाइट गिलार्डिया थेटा (जीटीएसीआर)15में प्राकृतिक एसीआर की खोज की गई । जैसा कि इंजीनियर एसीआर ने अवशिष्ट के आचरण को दिखाया, उन्हें प्राकृतिक एसीआर द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, जिसकी विशेषता एक बड़े एकल चैनल चालन और उच्च प्रकाश संवेदनशीलता15थी। जीटीएसीआर का उपयोग क्लोराइड16,17की उलटक्षमता की ओर झिल्ली क्षमता का ध्रुवीकरण करके न्यूरोनल गतिविधि को शांत करने के लिए किया गया था । गोवोरुनोवा एट अल. ने रैट वेंट्रिकुलर सीएम को GtACR1 लागू किया और कम प्रकाश तीव्रता के स्तर पर कुशल फोटोहिचक दिखाया जो प्रोटोन पंप आर्क18जैसे पहले उपलब्ध अवरोध उपकरणों को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त नहीं थे। हमारे समूह ने हाल ही में बताया कि सीएम का GtACR1-मध्यस्थता फोटोअवरोधध्रुवीकरण पर आधारित है और इसलिए, सीएम19की ऑप्टिकल पेसिंग के लिए GtACR1 का भी उपयोग किया जा सकता है ।
यहां, हम सुसंस्कृत खरगोश वेंट्रिकुलर सीएम पर GtACR1 फोटोएक्टिवेशन के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और मैकेनिकल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम पहले सेल अलगाव, पुलिया और ट्रांसड्यूक्शन का वर्णन करते हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रभाव पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके मापा जाता है। एक दी गई झिल्ली वोल्टेज पर हल्की मध्यस्थता वाली धाराओं का मूल्यांकन वी-क्लैंप मोड में किया जाता है। झिल्ली संभावित गतिशीलता को विद्युत या ऑप्टिकल रूप से पेसिंग सीएम (आई-क्लैंप मोड) के दौरान मापा जाता है। विद्युत रूप से ट्रिगर एपी के ऑप्टिकल अवरोध निरंतर प्रकाश आवेदन का उपयोग करपरीक्षण किया जाता है। यांत्रिक प्रभाव इमेजिंग के संयोजन में कार्बन फाइबर का उपयोग कर मापा जाता है सरकोमे लंबाई के ट्रैकिंग आधारित है । ऐसा करने के लिए, ऑप्टिकल रूप से तेज कोशिकाओं को विपरीत कोशिका सिरों के पास प्लाज्मा झिल्ली में दो कार्बन फाइबर संलग्न करके यांत्रिक रूप से प्रीलोड किया जाता है। ऑप्टिकल या इलेक्ट्रिकल पेसिंग के दौरान सरकोरे लंबाई में बदलाव दर्ज किए जाते हैं। अंत में, कोशिकाओं के विद्युत क्षेत्र उत्तेजना के दौरान फोटोसंकोच मापा जाता है, और उत्पन्न बलों का विश्लेषण किया जाता है।
प्रोटोकॉल में चित्रा 1में फ्लोचार्ट में दिखाए गए निम्नलिखित कदम शामिल हैं: खरगोश डीप एनेस्थीसिया, थिओपेनटल ओवरडोज इंजेक्शन, हार्ट एक्सिजन, लैंगेंडोर्फ-परफ्यूजन और ऊतक पाचन, कोशिकाओं को छोड़ने के लिए ऊतक का यांत्रिक विरक्तन, सीएम यील्ड का सूक्ष्म विश्लेषण, सीएम की विविधता, एडेनोवायरस टाइप 5 के साथ ट्रांस्क्शन, ऊष्मायन और कार्यात्मक प्रयोगों के बाद।
चित्रा 1: विद्युत और ऑप्टिकल रूप से तेज सीएम प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का फ्लोचार्ट। दिल खरगोशों से 9-10 सप्ताह पुराने उत्पादित कर रहे हैं, और हृदय ऊतक पचा रहा है, जबकि एक Langendorff सेटअप का उपयोग कर perfused जा रहा है । कोशिकाओं को यांत्रिक आंदोलन द्वारा जारी किया जाता है। सीएम यील्ड की गिनती माइक्रोस्कोप के नीचे होती है। सीएम सुसंस्कृत हैं, एडेनोवायरस प्रकार 5 के साथ ट्रांसड्यूस किए जाते हैं और कार्यात्मक प्रयोग ट्रांसड्यूक्शन के बाद 48-72 घंटे किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
जबकि ऑप्टोजेनेटिक उपकरण एक गैर-आक्रामक तरीके से उत्तेजनीय सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के मॉड्यूलेशन को सक्षम करते हैं, उन्हें एक विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए सर्वोत्तम उपलब्ध उपकरण चुनने की अनुमति देने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों (जैसे, सीएम) में पूरी तरह से लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है। पैच-क्लैंप तकनीक सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का आकलन करने के लिए एक मानक विधि है। पूरे सेल विन्यास में, यह एक प्रकाश उत्तेजना के बाद प्लाज्मा झिल्ली या झिल्ली वोल्टेज में लौकिक परिवर्तन भर में फोटो सक्रिय धाराओं रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देता है/ विद्युत उत्तेजना के ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर भी सीएम संकुचन को प्रभावित करता है। हम मायोसाइट्स की यांत्रिक गतिविधि पर ऑप्टिकल पूछताछ के प्रभावों की मात्रा निर्धारित करने के लिए सरकोमेरे ट्रैकिंग और कार्बन फाइबर-असिस्टेड फोर्स माप का उपयोग करते हैं।
हम सीएम में हल्के गेटेड क्लोराइड चैनल, GtACR1 के बुनियादी प्रभावों को चित्रित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। मॉडल प्रणाली के रूप में, हमने खरगोश के सीएम को चुना, क्योंकि उनकी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताएं (उदाहरण के लिए, एपी आकार और रिफ्रैक्टरी अवधि) कृंतक सीएम की तुलना में मानव सीएम में देखे गए लोगों के समान होती हैं। इसके अलावा, खरगोश सीएम को कई दिनों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है, जो एडेनोवायरल डिलीवरी और GtACR1-eGFP की अभिव्यक्ति के लिए काफी लंबा है। विशेष रूप से, अलग-थलग पड़े मुख्यमंत्री समय के साथ संस्कृति में अपने संरचनात्मक गुणों को बदलते हैं, जिसमें सेल एंडिंग की पूर्णाहुति और क्रॉस-स्ट्रीशन, टी-ट्यूबलर सिस्टम और कैवेओला23,24का क्रमिक नुकसान शामिल है। इसके अनुरूप, सुसंस्कृत सीएम में कार्यात्मक परिवर्तन ों की सूचना दी गई है: आराम झिल्ली क्षमता का ध्रुवीकरण, एपी का दीर्घीकरण और सेलुलर सीए2 + हैंडलिंग में परिवर्तन। संस्कृति में सेलुलर रूपांतरों की समीक्षा के लिए, कृपया Louch एट अल25देखें । पूरक चित्रा 2 यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके सुसंस्कृत सीएम(चित्रा 6, चित्रा 7)में मनाए गए लोगों के साथ तुलना के लिए हौसले से अलग हुए सीएम के अनुकरणीय एपी और संकुचन माप को दर्शाता है।
पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग फोटोकरंट गुणों (जैसे, आयाम और काइनेटिक्स) के प्रत्यक्ष माप और उच्च लौकिक संकल्प पर झिल्ली क्षमता या एपी विशेषताओं में प्रकाश-प्रेरित परिवर्तन सक्षम करते हैं। हालांकि, इस तरह की रिकॉर्डिंग की कई सीमाएं हैं: सबसे पहले, साइटोसोल को पूरे सेल रिकॉर्डिंग में पिपेट समाधान द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जो आयनिक इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट को नियंत्रित करने के लिए लाभप्रद है, लेकिन सेलुलर ऑर्गेनेल्स, प्रोटीन और अन्य यौगिकों को धोने का आंतरिक नुकसान है, इस प्रकार संभावित रूप से सेलुलर विद्युत प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है। दूसरे, गैर-शारीरिक रूप से लंबे ध्रुवीकरण (जैसे, हल्के-गेटेड आयन चैनलों के धीमे समय के स्थिरता) के परिणामस्वरूप अतिरिक्त आयन चैनलों की सक्रियता जैसे दुष्प्रभावों का आकलन करना मुश्किल है क्योंकि हमारी विधि केवल एपीडी में परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति देती है, लेकिन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रूप से प्रासंगिक कोशिका डिब्बों में आयनिक सांद्रता के प्रत्यक्ष मापन का संचालन नहीं करती है। यह फ्लोरोसेंट संकेतकों (जैसे, सीए 2+ सेंसर) या आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड के साथ किया जा सकता है। इसके अलावा लक्षण वर्णन में प्रकाश तीव्रता टिट्रेशन, पीएच-निर्भरता का निर्धारण, विभिन्न झिल्ली क्षमता ओं पर फोटोकरंट काइनेटिक्स, और दोहराव प्रकाश उत्तेजना के दौरान रिकवरी काइनेटिक्स शामिल हो सकते हैं।
पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के विपरीत, एकल-सेल बल माप उनके इंट्रासेलर परिवेश को प्रभावित किए बिना बरकरार मायोसाइट्स के सेलुलर संकुचन का विश्लेषण सक्षम करते हैं। आयन सांद्रता पर माध्यमिक प्रभाव (उदाहरण के लिए, सीए2 +)का अप्रत्यक्ष रूप से उत्पन्न बल आयाम और गतिशीलता (उदाहरण के लिए, संकुचन और विश्राम का अधिकतम वेग) का निर्धारण करके मूल्यांकन किया जा सकता है; यहां विश्लेषण नहीं किया गया है)। कार्बन फाइबर तकनीक के साथ बल माप को स्वतंत्र रूप से अनुबंधित कोशिकाओं पर एक लाभ होता है क्योंकि वे पूर्व-भरी हुई कोशिकाओं में निष्क्रिय और सक्रिय बलों के बारे में सीधी जानकारी प्रदान करते हैं (यानी, उन स्थितियों में जो सीटू या वीवो सेटिंग्स में अधिक समान हैं)। सेलुलर संकुचन का विश्लेषण करते समय मैकेनिकल प्रीलोडिंग विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि खिंचाव बल उत्पादन और विश्राम26,27को प्रभावित करता है।
ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण एकल सीएम और अक्षुण्ण हृदय ऊतक दोनों में सेलुलर झिल्ली क्षमता के स्थानिक रूप से सटीक हेरफेर की अनुमति देते हैं। शास्त्रीय रूप से, एक हल्के-गेटेड सेशन गैर-चयनात्मक चैनल, ChR2 का उपयोग झिल्ली क्षमता के ध्रुवीकरण के लिए किया गया है, जबकि झिल्ली हाइपरपोलीकरण के लिए हल्के चालित प्रोटोन और/या क्लोराइड पंपों का उपयोग किया गया था । ऑप्टोजेनेटिक एक्टूएटर के दोनों समूहों को उच्च अभिव्यक्ति के स्तर की आवश्यकता होती है, क्योंकि ChR2 को आंतरिक रूप से कम एकल-चैनल चालन28 और प्रकाश-चालित पंपों द्वारा अवशोषित फोटॉन प्रति एक आयन का परिवहन किया जाता है। इसके अलावा, सीएम में ChR2 के लंबे समय तक सक्रियता ना+ और/या Ca2 + अधिभार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और प्रकाश चालित पंपों ट्रांस-sarcolemmal एच+ यासीएल-ढाल 29,30बदल सकते हैं । सीएम गतिविधि के ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण के लिए वैकल्पिक उपकरणों की तलाश में, हमने हाल ही में प्राकृतिक एनियन चैनलरोडोप्सिन GtACR1 का परीक्षण किया, जो ChR2 जैसे cation ChR की तुलना में एक बेहतर एकल चैनल आचरण और उच्च प्रकाश संवेदनशीलता की विशेषता है। हमने पाया कि GtACR1 सक्रियण सीएम depolarizes और ऑप्टिकल पेसिंग और निषेध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रकाश पल्स समय और अवधि के आधार पर । सीएचआर के बजाय एसीआर का उपयोग करने का एक अतिरिक्त लाभ सीएल की अधिक नकारात्मक उलटक्षमता हो सकती है– एनए+की तुलना में, कृत्रिम रूप से शुरू की गई आयन धाराओं को कम करना। जैसा कि हमने पहले दिखाया है, GtACR1 के साथ ऑप्टिकल पेसिंग GtACR1 चैनल बंद होने के धीमे घटक के परिणामस्वरूप एपी दीर्घीकरण का कारण बन सकता है, जिसे तेजी से GtACR1 म्यूटेंट19का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। हालांकि, एपी दीर्घीकरण बहुत कम स्पष्ट है जब एक कम, अधिक शारीरिक इंट्रासेलुलर सीएल का उपयोगकर-एकाग्रता (चित्रा 6देखें) । इसके अलावा, लंबे समय तक रोशनी से जीटीए1-मध्यस्थता अवरोध गहरा झिल्ली ध्रुवीकरण में परिणाम देता है, जो फिर से माध्यमिक एनए+ और सीए2 + बाढ़ को सक्रिय कर सकता है, जिससे वोल्टेज-गेटेड चैनलों की गतिविधि में फेरबदल होता है। हमारे माप में, हम पाते हैं कि एपी और संकुचन पैरामीटर 1 मिनट के लिए प्रकाश-प्रेरित अवरोध के बाद 40 एस के भीतर बेसलाइन पर ठीक हो जाते हैं (कोप्टन एट अल 2018, चित्रा 6, चित्रा 7देखें)। हल्के-गेटेड के+ चैनल सीएम को झिल्ली क्षमता31को प्रभावित किए बिना सीएम को मुंह बंद करने के लिए एक शक्तिशाली विकल्प प्रदान करते हैं ।
भविष्य में हम कार्डियक गतिविधि को बाधित करने की उनकी क्षमता के लिए विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों की मात्रात्मक तुलना करना चाहते हैं। इस उद्देश्य के लिए, हम एसीआर, ChR2 और लाल-स्थानांतरित सीएचआर वेरिएंट32सहित विभिन्न प्रकार के प्रकाश-गेटेड आयन चैनलों का परीक्षण करते हैं, साथ ही हेलोरोडोडोप्सिन या लाइट गेटेड एडेनेलइल साइक्लेस बीपीएसी जैसे पोटेशियम चैनल SthK (PAC-K)31के संयोजन में हाइपरपोलराइजिंग एक्टूएटर का परीक्षण करते हैं।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग सीएम के विद्युत गुणों के गहन लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है। यह मुख्य रूप से अन्य प्रजातियों के सीएम और रोगग्रस्त मायोकार्डियम से अलग सीएम पर भी लागू होता है। ऑप्टिकल उत्तेजना एक विभिन्न आवृत्तियों पर सीएम गति करने के लिए अनुमति देता है, और कार्बन फाइबर संकुचन प्रयोगों के दौरान विभिन्न प्रीलोड का परीक्षण किया जा सकता है। एक दिलचस्प प्रयोग सबथ्रेसल ध्रुवीकरण के लिए कम तीव्रता वाली रोशनी का उपयोग करना होगा, आराम झिल्ली क्षमता में क्रमिक वृद्धि की नकल करने के लिए, जैसा कि रोग प्रगति के दौरान हृदय ऊतक रीमॉडलिंग के विकास के दौरान देखा जा सकता है। अंत में, कार्यात्मक माप को सीए2 + इमेजिंग के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि एक्सटॉ्शन-संकुचन युग्मन में आगे की अंतर्दृष्टि हो, या मुख्यमंत्री गतिविधि पर विभिन्न दवाओं के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए औषधीय हस्तक्षेप ों के साथ।
The authors have nothing to disclose.
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए स्टेफनी पेरेस-फेलिज का शुक्रिया अदा करते हैं, डॉ जोनास विस्टेक (हम्बोल्ट-यूनिवर्सिटी, बर्लिन, जर्मनी) pUC57-GtACR1 प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए, प्रो डॉ माइकल Schupp (Charité-Universitätsmedizin बर्लिन, Institut für फार्माकोलोजी, बर्लिन) adenovirus उत्पादन के लिए और डॉ अनास्तासिया खोखलोवा (यूराल फेडरल यूनिवर्सिटी) को सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल और फिर से डिजाइन करने के लिए अपनी विशेषज्ञता साझा करने के लिए प्रदान करने के लिए परियोजना जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (SPP1926: SCHN 1486/1-1 द्वारा वित्त पोषित किया गया था; एमी-Noether फैलोशिप: SCHN1486/2-1) और ईआरसी एडवांस्ड ग्रांट कार्डियोनेक्ट ।
Equipment – Cell isolation/Culturing/Transduction | |||
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV | TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA | ||
Aortic cannula | Radnoti | 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm | |
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0151 | Borosilicate Glass |
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm | Samuel Findings, London, UK | TSGBL3 | |
Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland | Galaxy 170S | |
Langendorff-perfusion set-up | Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany | Custom-made | |
Langendorff-pump | Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland | ISM444 | |
Mesh: Nylon Monodur filter cloth | Cadisch Precision Meshes Ltd | 800 µm holes, 1 m wide | |
Neubauer chamber | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 717806 | |
Rabbit, New Zealand White | Charles River | Strain Code: 052 | |
Scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BC774R | Bauchdeckenschere ger. 18cm |
Sterile filter, 0.22 µm | Merck, Darmstadt, Germany | SLGP033RB | |
Equipment – Patch-clamp | |||
Amplfier | AxonInstruments, Union City, CA, United States | Axopatch 200B | |
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0178 | Borosilicate Glass |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, San José, CA, United States | 1550A | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | BZ:00 |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Headstage | AxonInstruments, Union City, CA, United States | CV203BU | |
Interface | Scientifica, Uckfield, UK | 1U Rack, 352036 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control software | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PP-830 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
Motorised Micromanipulator | Scientifica, Uckfield, UK | PatchStar | |
Optical power meter | Thorlabs, Newton, NJ, United States | PM100D | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Silver wire | A-M Systems, Sequim, WA, United States | 787500 | Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet |
Soda lime glass capillaries | Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark | 160213 BRIS, ISO12772 | 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Equipment – Carbon fiber | |||
Carbon fibers | provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec | BZ:00 | |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States | 1550B | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Fluorescence System Interface | IonOptix, Milton, MA United States | FSI-800 | 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm |
Force Transducer System | Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada | 406A | |
Glass capillaries for force measurements | Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States | GC200F-10 | |
Interface National Instruments | National Instruments, Budapest, Hungary | BNC-2110 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control box | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Microcontroller | Parallax Inc., Rocklin, California, United States | Propeller | |
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PC-10 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
MyoCam-S camera | IonOptix, Dublin, Ireland | ||
MyoCam-S camera Power | IonOptix, Milton, MA, United States | MCS-100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States | MYP100 | |
Piezo Motor | Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | E-501.00 | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software IonWizard | IonOptix, Dublin, Ireland | Version 6.6.10.125 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Chemicals | |||
Adenosine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9251-100G | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A7030-50G | |
CaCl2 | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 21114-1L | |
L-Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C9500-25G | |
Collagenase type 2, 315 U/mg | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS004177 | |
Creatine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C0780-50G | |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C1768-100MG | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3054.3 | |
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL | Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany | PZN-07829486 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | F9665 | |
Gentamycin 50 mg/mL | Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA | 15750-037 | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | G7021-1KG | |
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | PZN-03029843 | |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | H3375-1KG | |
Insulin (bovine pancreas) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | I6634-50MG | |
K-aspartate | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A6558-25G | |
KCl | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 26764.260 | 1 mg/mL |
KOH | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 35113-1L | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | L2020-1MG | |
M199-Medium | Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States | M4530 | |
Mg-ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9187-1G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 63069-500ML | |
NaCl | Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK | 10428420 | |
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
NaOH | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A6579 | without Ca2+/Mg2+ |
Na-pyruvat | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P2256-100MG | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | D1408-500ML | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma, Poole, UK | 192066 | |
Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P5147-1G | |
Taurine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | T0625-500G | |
Thiopental Inresa 0.5 g | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | PZN-11852249 | |
Xylazine hydrochloride, Rompun 2% | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN-01320422 |