Analisi spaziale temporale del flusso Fieldwise nella microvascolatura
Summary
Per quantificare il flusso microvascolare dalle sequenze di immagini capillari ad alta velocità, abbiamo sviluppato il software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Nell’intero campo dell’immagine e nel tempo, STAFF valuta le velocità di flusso e genera una sequenza di mappe spaziali codificate a colori per la visualizzazione e l’output tabulare per le analisi quantitative.
Abstract
I cambiamenti nella velocità e nella distribuzione del flusso sanguigno sono fondamentali per mantenere la perfusione di tessuti e organi in risposta a diverse esigenze cellulari. Inoltre, la comparsa di difetti nella microcircolazione può essere un indicatore primario nello sviluppo di più patologie. I progressi nell’imaging ottico hanno reso la microscopia intravitale (IVM) un approccio pratico, permettendo l’imaging a livello cellulare e subcellulare negli animali vivi ad alta velocità nel tempo. Tuttavia, nonostante l’importanza di mantenere un’adeguata perfusione dei tessuti, la variabilità spaziale e temporale nel flusso capillare è raramente documentata. Nell’approccio standard, un piccolo numero di segmenti capillari viene scelto per l’imaging in un periodo di tempo limitato. Per quantificare in modo completo il flusso capillare in modo imparziale, abbiamo sviluppato Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), una macro per il software di analisi delle immagini open source FIJI. Utilizzando sequenze di immagini ad alta velocità di campi completi del flusso sanguigno all’interno dei capillari, STAFF produce immagini che rappresentano il movimento nel tempo chiamate kymographs per ogni intervallo di tempo per ogni segmento vascolare. Dai kymographs STAFF calcola le velocità dalla distanza di spostamento dei globuli rossi nel tempo e restituisce i dati sulla velocità come una sequenza di mappe spaziali codificate a colori per la visualizzazione e l’output tabulare per le analisi quantitative. Nei normali fegati di topo, STAFF analizza profonde differenze di velocità di flusso tra le regioni pericentrali e periportali all’interno dei lobuli. Ancora più inaspettate sono le differenze di velocità di flusso osservate tra i sinusoidi che sono affiancati e le fluttuazioni osservate all’interno di singoli segmenti vascolari nel corso dei secondi. STAFF è un nuovo potente strumento in grado di fornire nuove intuizioni consentendo la misurazione delle complesse dinamiche spatiotemporali del flusso capillare.
Introduction
La microvascolatura svolge un ruolo fondamentale nella fisiologia, garantendo una perfusione efficace dei tessuti in condizioni mutevoli. Disfunzione microvascolare è associata a una miriade di condizioni tra cui morbilità cardiovascolare a lungo termine e mortalità, sviluppo di demenza, e malattia di fegato e rene e quindi è un fattore chiave di interesse in una vasta gamma di indagini biomediche1,2,3,4,5. Mentre sono state utilizzate più tecniche per valutare la perfusione tissutale, solo la microscopia intravitale consente la raccolta dei dati alla risoluzione temporale e spaziale necessaria per caratterizzare il flusso sanguigno a livello dei singoli capillari.
Il flusso microvascolare può essere visualizzato in microscopia a fluorescenza sia dal movimento delle microsfere fluorescenti che dal movimento dei globuli rossi sullo sfondo di marcatori fluorescenti impersi della membrana (ad esempio, dextran fluorescente o albumin)6,7. Il flusso microvascolare può essere fotografato in strati cellulari superficiali utilizzando la microscopia widefield, o in profondità utilizzando la microscopia confocale o multifotona. Tuttavia, i flussi capillari sono tali che il passaggio dei globuli rossi non può generalmente essere catturato a velocità inferiori a 60 fotogrammi/s. Poiché la maggior parte dei microscopi a scansione laser confocale e multifotona richiedono da 1 a 5 s per eseguire la scansione di un campo immagine completo, questa velocità può generalmente essere raggiunta solo limitando il campo visivo, a volte a una singola linea di scansione8. Il processo di limitazione delle misurazioni a segmenti capillari selezionati (1) ha il potenziale per introdurre una distorsione di selezione e (2) rende impossibile catturare l’eterogeneità spaziale e temporale nei tassi di flusso sanguigno capillare. Al contrario, le immagini delle reti capillari possono essere raccolte a velocità superiori a 100 fps utilizzando microscopi digitali widefield dotati di telecamere scientifiche a semiconduttore di ossido di metallo complementare (sCMOS)9,10. Questi sistemi poco costosi, comuni nei tipici laboratori biomedici, consentono di immaginare il flusso microvascolare attraverso intere reti bidimensionali, essenzialmente continuamente. Il problema diventa quindi quello di trovare un approccio di analisi in grado di estrarre dati quantitativi significativi dai set di dati di immagini massicci e complessi generati dalla microscopia video ad alta velocità.
Per consentire l’analisi dei dati di flusso a campo completo abbiamo sviluppato STAFF, un nuovo software di analisi delle immagini in grado di misurare continuamente il flusso microvascolare in interi campi al microscopio delle serie di immagini raccolte ad alta velocità11. L’approccio è compatibile con una varietà di diversi sistemi sperimentali e modalità di imaging e il software di analisi delle immagini STAFF è implementato come un set di strumenti macro per l’implementazione FIJI di ImageJ12. Il principio di base usato qui per visualizzare il flusso microvascolare è che in primo luogo, qualche contrasto deve essere fornito per essere in grado di immaginare i globuli rossi all’interno dei capillari. Nei nostri studi, il contrasto è fornito da una sonda fluorescente sfusa che è esclusa dai globuli rossi. La velocità di flusso può quindi essere quantificata dallo spostamento dei globuli rossi che appaiono come una macchia negativa all’interno del plasma fluorescente in immagini raccolte ad alta velocità da un animale vivente8. Usiamo quindi STAFF per fare tracciati di distanza lungo ogni segmento capillare su più intervalli di tempo chiamati kymographs, quindi rileviamo le pendenze presenti nei kymografi13,e da quelle pendenze calcoliamo i tassi di flusso microvascolare. L’approccio può essere applicato alle immagini raccolte da qualsiasi letto capillare accessibile per l’imaging. Qui descriviamo l’applicazione di IVM e STAFF agli studi del flusso sanguigno nel fegato.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo sono previsti più passaggi critici. In primo luogo, la minimizzazione del movimento durante l’imaging intravitale del fegato è essenziale per generare filmati che sono utilizzabili per l’analisi del flusso capillare utilizzando STAFF. A causa della vicinanza del diaframma, si verificano brevi periodi di movimento indotta dalla respirazione, con il fegato assicurato che ritorna alla sua posizione iniziale dopo ogni respiro. Fissare il fegato a comparsa chirurgica contro la parabola dal fondo del cop…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli studi qui presentati sono stati sostenuti dai finanziamenti dei National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 e NIH NIDDK P30 DK079312). Gli studi di microscopia intravitale sono stati condotti presso l’Indiana Center for Biological Microscopy. Ringraziamo il Dr. Malgorzata Kamocka per assistenza tecnica con microscopia.
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
Referências
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