微小血管系におけるフィールドワイズフローの空間時間解析
Summary
高速キャピラリーフロー画像シーケンスから微小血管流れを定量化するために、STAFF(フィールドワイズフローの空間時間解析)ソフトウェアを開発しました。フルイメージフィールド全体および時間の経過とともに、STAFFはフロー速度を評価し、定量分析のための視覚化と表形式出力のための色分けされた空間マップのシーケンスを生成します。
Abstract
血流速度と分布の変化は、様々な細胞のニーズに応じて組織や臓器の灌流を維持するために不可欠です。また、微小循環における欠陥の出現は、複数の病理の発症における主要な指標であり得る。光学イメージングの進歩により、バイタル顕微鏡(IVM)は実用的なアプローチとなり、生きている動物の細胞および細胞下レベルでのイメージングを時間の経過とともに高速化しました。しかし、十分な組織灌流を維持することの重要性にもかかわらず、毛細管流における空間的および時間的変動はめったに文書化されていない。標準的なアプローチでは、限られた時間をかけてイメージングするために少数の毛細管セグメントが選択される。フィジーオープンソース画像解析ソフトウェアのマクロであるフィールドワイズフローの空間時間解析(STAFF)を開発し、公平な方法で毛細管の流れを総合的に定量化しました。毛細血管内の血流の完全なフィールドの高速画像シーケンスを使用して、STAFFは、すべての血管セグメントのための時間間隔ごとにキモグラフと呼ばれる時間の経過とともに動きを表す画像を生成します。KYmographs STAFFからは、赤血球が時間の経過とともに移動する距離から速度を計算し、定量分析のための視覚化と表形式出力のための色分けされた空間マップのシーケンスとして速度データを出力します。通常のマウス肝臓では、STAFF分析は、小葉の中のペリセントラル領域とペリポータル領域間の流速の深い差を定量化した。さらに予想外ののののは、並んで並んでいるシヌコイドと、個々の血管セグメント内で数秒にわたって見られる変動の間に見られる流速の違いです。STAFFは毛細管の流れの複雑な時空間ダイナミクスの測定を可能にすることによって新しい洞察を提供することができる強力な新しい用具である。
Introduction
微小血管系は生理学において重要な役割を果たし、変化する条件下で組織の効果的な灌流を保証する。微小血管機能障害は、長期的な心血管罹患率および死亡率、認知症の発症、および肝臓と腎臓の両方の疾患を含む無数の状態に関連しており、したがって、広範な生物医学的調査における関心の重要な要因である1、2、3、4、5。組織灌流を評価するために複数の技術が用いられてきたが、生内顕微鏡によってのみ、個々の毛細血管のレベルで血流を特徴付けるために必要な時間的および空間的な分解能でデータ収集を可能にする。
微小血管流れは、蛍光微小球の動きまたは膜不浸透蛍光マーカーの背景に対する赤血球の動き(例えば、蛍光標識デキストランまたはアルブミン)6、7のいずれかによって蛍光顕微鏡で可視化することができる。微小血管の流れは、広視野顕微鏡を用いて表面的な細胞層で、または共焦点または多光子顕微鏡を用いて深さで画像化することができる。しかし、毛細管流量は、赤血球の通過が一般的に60フレーム/s未満の速度で捕捉することができないようなものである。ほとんどのレーザー走査共焦点顕微鏡および多光子顕微鏡は、フル画像フィールドをスキャンするために1〜5sを必要とするので、この速度は、一般的に視野を制限することによってのみ達成することができ、時には単一のスキャンライン8に。選択された毛細血管セグメント(1)に測定を制限するプロセスは、選択バイアスを導入する可能性があり、(2)毛細管血流の速度における空間的および時間的不均一性を捕捉することが不可能である。対照的に、キャピラリーネットワークの画像は、科学的相補金属酸化物半導体(sCMOS)カメラ9、10を搭載したワイドフィールドデジタル顕微鏡を使用して、100fpsを超える速度で収集することができる。これらの安価なシステムは、典型的な生物医学実験室で一般的であり、本質的に連続的に、2次元ネットワーク全体にわたる微小血管の流れを画像化することを可能にする。この問題は、高速ビデオ顕微鏡によって生成された膨大で複雑な画像データセットから有意義な定量データを抽出できる解析アプローチを見つける方法の1つになります。
全場流量データの解析を可能にするために、高速11で収集した画像系列の顕微鏡分野全体を通して微小血管流量を連続的に測定できる新規画像解析ソフトウェアSTAFFを開発しました。このアプローチは、様々な実験システムやイメージングモダリティと互換性があり、STAFF画像解析ソフトウェアはImageJ12のFIJI実装のためのマクロツールセットとして実装されています。微小血管の流れを可視化するためにここで使用される根本的な原理は、まず、毛細血管内の赤血球を画像化できるようにいくつかのコントラストを提供しなければならないということです。我々の研究では、コントラストは赤血球によって除外されるバルク蛍光プローブによって提供される。流れの速度は、生きている動物8から高速に収集された画像において蛍光標識プラズマ内に負の染色として現れる赤血球の変位から定量することができる。次に STAFF を使用して、キモグラフと呼ばれる複数の時間間隔で各キャピラリー セグメントに沿った距離のプロットを作成し、キモグラフ13に存在する勾配を検出し、それらの勾配から微小血管流量を計算します。このアプローチは、イメージングのためにアクセスできる任意の毛細血管ベッドから収集された画像に適用することができます。ここでは、肝臓の血流の研究にIVMとSTAFFの適用について説明します.
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルには複数の重要な手順があります。まず、LIVERを用いた毛細管流解析に利用できる映画を生成するためには、肝臓の生態中イメージング中の運動の最小化が不可欠です。横隔膜の近接性のために、呼吸誘発運動の短い期間が発生し、各呼吸後に安全な肝臓が初期位置に戻る。ガーゼを用いてカバースリップ底皿に対して外科的に露出した肝臓を固定し、その後、逆顕微鏡を用?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ここで提示された研究は、国立衛生研究所(NIH U01 GM111243およびNIH NIDDK P30 DK079312)からの資金提供によって支えられました。インディアナ生物顕微鏡センターでバイタル内顕微鏡研究を行いました。マルゴルザータ・カモッカ博士の顕微鏡検査の技術支援に感謝します。
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
Referências
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