Para quantificar o fluxo microvascular de sequências de imagem capilar de fluxo de alta velocidade, desenvolvemos o software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Em todo o campo de imagem completo e ao longo do tempo, a EQUIPE avalia as velocidades de fluxo e gera uma sequência de mapas espaciais codificados por cores para visualização e saída tabular para análises quantitativas.
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Artigo de método
Análise Temporal Espacial do Fluxo de Campo na Microvasculatura
Neste artigo
Resumo
Resumo
As alterações na velocidade e distribuição do fluxo sanguíneo são vitais para manter a perfusão de tecidos e órgãos em resposta às diferentes necessidades celulares. Além disso, o aparecimento de defeitos na microcirculação pode ser um indicador primário no desenvolvimento de múltiplas patologias. Os avanços nas imagens ópticas fizeram da microscopia intravital (IVM) uma abordagem prática, permitindo imagens a nível celular e subcelular em animais vivos em alta velocidade ao longo do tempo. No entanto, apesar da importância de manter a perfusão de tecido adequada, a variabilidade espacial e temporal no fluxo capilar raramente é documentada. Na abordagem padrão, um pequeno número de segmentos capilares são escolhidos para imagens ao longo de um tempo limitado. Para quantificar de forma abrangente o fluxo capilar de uma forma imparcial, desenvolvemos a Análise Temporal Espacial do Fluxo De Campo (STAFF), uma macro para o software de análise de imagem de código aberto de FIJI. Usando sequências de imagem de alta velocidade de campos cheios de fluxo sanguíneo dentro de capilares, staff produz imagens que representam o movimento ao longo do tempo chamado kymographs para cada intervalo de tempo para cada segmento vascular. A partir dos kymographs STAFF calcula velocidades da distância que os glóbulos vermelhos se movem ao longo do tempo, e fornece os dados de velocidade como uma seqüência de mapas espaciais codificados por cores para visualização e saída tabular para análises quantitativas. Em fígados de camundongos normais, a STAFF analisa diferenças profundas quantificadas na velocidade do fluxo entre regiões pericentrais e periportal dentro dos lóbulos. Ainda mais inesperadas são as diferenças na velocidade do fluxo observadas entre os sinusoids que estão lado a lado e flutuações observadas dentro de segmentos vasculares individuais ao longo de segundos. A EQUIPE É uma nova ferramenta poderosa capaz de fornecer novos insights, permitindo a medição da complexa dinâmica espaçotemporal do fluxo capilar.
Introdução
A microvasculatura desempenha um papel crítico na fisiologia, garantindo uma perfusão eficaz de tecidos em condições de mudança. A disfunção microvascular está associada a inúmeras condições, incluindo morbidade cardiovascular e mortalidade a longo prazo, desenvolvimento de demência e doença de fígado e rim e, portanto, é um fator-chave de interesse em uma ampla gama de investigações biomédicas1,2,3,4,5. Embora várias técnicas tenham sido usadas para avaliar a perfusão de tecidos, apenas a microscopia intra....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes do Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade de Indiana, e aderiram ao guia nrc para o cuidado e uso de animais.
1. Preparação cirúrgica para microscopia intravital
Nota: Isto não é uma cirurgia de sobrevivência. Uma vez iniciada a seção 1 "Preparação cirúrgica para microscopia intravital", os trabalhos não podem ser pausados até a conclusão da seção 2 "Microscopia Intravital".
- Aclimatize 9-10 ratos machos C57BL/6, por pelo menos 4 dias e rápido para 16 h antes dos estudos. ....
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Resultados
A análise da equipe gera um censo completo de velocidades microvasculares em campos de microscópio inteiros ao longo de períodos de tempo que se estende de segundos a minutos. Os resultados representativos são apresentados na Figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4. A Figura 1 mostra um exemplo de uma série temporal da rede microvascular no fígado de um camundongo, a geração.......
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Discussão
Há vários passos críticos neste protocolo. Primeiro, a minimização do movimento durante a imagem intravital do fígado é essencial para gerar filmes que são utilizáveis para análise de fluxo capilar usando staff. Devido à proximidade do diafragma, ocorrem curtos períodos de movimento induzido pela respiração, com o fígado seguro retornando à sua posição inicial após cada respiração. Proteger o fígado exposto cirurgicamente contra o prato com fundo de coverslip usando gaze, em seguida, a imagem de baixo usando um microscóp.......
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Divulgações
Os autores não relatam nenhum interesse concorrente.
Agradecimentos
Estudos apresentados aqui foram apoiados por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH U01 GM111243 e NIH NIDDK P30 DK079312). Estudos de microscopia intravital foram realizados no Indiana Center for Biological Microscopy. Agradecemos ao Dr. Malgorzata Kamocka por assistência técnica com microscopia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| # 5 fórceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont # 5 Inox Fórceps |
| C57BL / 6 camundongos | Jackson Labs | macho 9-12 semanas de idade | |
| Cânula | Instech | BTPE-10 | Tubo de polietileno 0,011 x 0,024 polegadas |
| Câmera CMOS | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Prato com fundo de lamínula | Microscopia eletrônica Sciences | WillCo Tesoura de dissecação com fundo de vidro GWST5040 | |
| de ciências | |||
| fiais Fiji ImageJ Software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluoresceína dextrana | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluoresceína, 70.000 MW, aniônico, lisina fixável |
| Esponja de gaze | Fisher | 22-415-504 | 2x2 polegadas Dukal esponjas de gaze estéril |
| Almofada de aquecimento | Reptitherm | RH-4 | entre o mouse e o palco |
| Almofada de aquecimento | Sunbeam | 000732-500-000U | sobre o mouse |
| Microscópio de epifluorescência invertida | Nikon | Nikon TiE microscópio invertido | |
| Isis Rodent barbeador elétrico | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorano | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Adaptador de ponta Luer | Fisher | 14-826-19E | Adaptador de cateter |
| Micro tesoura Castro | Viejo | ||
| Objetiva de microscópio | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0,75 agulha de imersão em água | |
| Fisher | 30 G x1/2" | ||
| Agulha suporte | Olsen-Hegar | ||
| Aquecedor de objetiva | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Controlador de temperatura com aquecedor de objetiva |
| Termômetro retal | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Monitoramento da temperatura corporal do mouse |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Cordão de sutura | Harvard Bioscience | 723288 | sutura de seda preta |
Referências
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M.
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Reimpressões e permissões
