Mikrovaskülüste AlanSal Akışın Mekansal Zamansal Analizi
Summary
Yüksek hızlı kılcal akış görüntü dizilerinden mikrovasküler akışı ölçmek için, PERSONEL (Alan Sala¤›l›K A¤›n›n Mekansal Zamansal Analizi) yaz›l›m› gelifltirildi. Tam görüntü alanı boyunca ve zaman içinde, STAFF akış hızlarını değerlendirir ve nicel analizler için görselleştirme ve tabular çıktı için renk kodlu uzamsal haritalar dizisi oluşturur.
Abstract
Kan akımı hızı ve dağılımındaki değişiklikler, değişen hücresel ihtiyaçlara yanıt olarak doku ve organ perfüzyonu nun sürdürülmesinde hayati önem taşımaktadır. Ayrıca, mikrosirkülasyonda kusurların ortaya çıkması birden fazla patolojinin gelişiminde birincil bir gösterge olabilir. Optik görüntülemedeki gelişmeler intravital mikroskopiyi (IVM) pratik bir yaklaşım haline getirerek, canlı hayvanlarda hücreli ve hücre altı düzeyde zaman içinde yüksek hızda görüntülemeye izin verebilmiştir. Ancak, yeterli doku perfüzyonu bakımının önemine rağmen, kapiller akış mekansal ve zamansal değişkenlik nadiren belgelenmiştir. Standart yaklaşımda, sınırlı bir süre içinde görüntüleme için az sayıda kılcal segment seçilir. Kapiller akışı tarafsız bir şekilde kapsamlı bir şekilde ölçmek için FIJI açık kaynak görüntü analizi yazılımı için bir makro olan Fieldwise Flow’un (STAFF) Mekansal Zamansal Analizini geliştirdik. Kapiller içinde kan akışının tam alanlarının yüksek hızlı görüntü dizilerini kullanarak, STAFF her vasküler segment için her zaman aralığı için kymographs denilen zaman içinde hareket temsil görüntüler üretir. Kymographs STAFF kırmızı kan hücrelerinin zaman içinde hareket mesafe hızları hesaplar ve kantitatif analizler için görselleştirme ve tabular çıkış için renk kodlu uzamsal haritalar dizisi olarak hız verileri çıktı. Normal fare karaciğerlerinde, PERSONEL lobüller içindeki pericentral ve periportal bölgeler arasındaki akış hızındaki derin farklılıkları analiz eder. Daha da beklenmeyen yan yana olan sinüzoidler ile saniyeler içinde tek tek vasküler segmentlerde görülen dalgalanmalar arasında görülen akış hızı farklılıklarıdır. STAFF, kılcal damar akışının karmaşık spatiotemporal dinamiklerinin ölçülmesini sağlayarak yeni bilgiler sağlayabilen yeni bir araçtır.
Introduction
Mikrovaskülatür fizyolojide kritik bir rol oynar, değişen koşullar altında dokuların etkili perfüzyon sağlanması. Mikrovasküler disfonksiyon uzun vadeli kardiyovasküler morbidite ve mortalite, demans gelişimi ve karaciğer ve böbrek hastalığı da dahil olmak üzere sayısız koşullar ile ilişkilidir ve böylece biyomedikal araştırmaların geniş bir yelpazede ilgi önemli bir faktördür1,2,3,4,5. Doku perfüzyonu değerlendirmek için birden fazla teknik kullanılırken, sadece intravital mikroskopi, bireysel kılcal damarlar düzeyinde kan akışını karakterize etmek için gerekli olan zamansal ve mekansal çözünürlükte veri toplamayı sağlar.
Mikrovasküler akış floresan mikrosferlerin hareketi ya da membran impermeant floresan belirteçleri arka plan karşı kırmızı kan hücrelerinin hareketi ile floresan mikroskopi mikroskopi görselleştirilmiş olabilir (örneğin, floresan etiketli dextran veya albumin)6,7. Mikrovasküler akış geniş alan mikroskobu kullanılarak yüzeysel hücre tabakalarında veya konfokal veya multifoton mikroskopi kullanılarak derinlemesine görüntülenebilir. Ancak, kılcal akış hızları kırmızı kan hücrelerinin geçişi genellikle 60 kare /s’den daha düşük hızlarda yakalanamaz. Çoğu lazer tarama confocal ve multifoton mikroskoplar tam bir görüntü alanı taramak için 1-5 s gerektirdiğinden, bu hız genellikle sadece görüş alanı sınırlayarak, bazen tek bir tarama hattı8gerçekleştirilebilir . Ölçümleri seçilen kılcal segmentlerle sınırlandırma süreci (1) seçim önyargısını ortaya koyma potansiyeline sahiptir ve (2) kapiller kan akımı oranlarında mekansal ve zamansal heterojenliği yakalamayı imkansız kılmıştır. Buna karşılık, kılcal ağların görüntüleri bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kameralar9,10ile donatılmış geniş alan lı dijital mikroskoplar kullanılarak 100 fps’yi aşan hızlarda toplanabilir. Tipik biyomedikal laboratuvarlarda yaygın olan bu ucuz sistemler, mikrovasküler akımı nisble tüm iki boyutlu ağlarda, aslında sürekli olarak görüntülemeyi mümkün kılmaktadır. Sorun daha sonra yüksek hızlı video mikroskobu tarafından oluşturulan büyük ve karmaşık görüntü veri kümelerinden anlamlı nicel veri ayıklama yeteneğine sahip bir analiz yaklaşımı bulma biri olur.
Tam alan akış verilerinin analizini sağlamak için, yüksek hızda toplanan görüntü serilerinin tüm mikroskop alanlarında mikrovasküler akışı sürekli olarak ölçebilen STAFF, yeni görüntü analiz yazılımı geliştirdik11. Yaklaşım farklı deneysel sistemler ve görüntüleme yöntemleri çeşitli ile uyumludur ve STAFF görüntü analizi yazılımı ImageJ12FIJI uygulaması için bir makro araç seti olarak uygulanmaktadır. Mikrovasküler akışı görselleştirmek için burada kullanılan temel ilke, ilk olarak, bazı kontrast kılcal damarlar içinde kırmızı kan hücrelerini görüntü edebilmek için sağlanmalıdır. Çalışmalarımızda kontrast, kırmızı kan hücreleri tarafından dışlanan toplu floresan sonda ile sağlanmaktadır. Akış hızı daha sonra canlı birhayvan8 yüksek hızda toplanan görüntülerde floresan etiketli plazma içinde negatif bir leke olarak görünen kırmızı kan hücrelerinin yerinden ölçülebilir . Daha sonra kymographs denilen zaman birden fazla aralıklar üzerinde her kılcal segment boyunca mesafe çizimleri yapmak için PERSONEL kullanın, daha sonra kymographs mevcut yamaçlarında tespit13, ve bu yamaçlardan mikrovasküler akış oranlarını hesaplamak. Bu yaklaşım, görüntüleme için erişilebilen herhangi bir kılcal yataktan toplanan görüntülere uygulanabilir. Burada karaciğerde kan akımı çalışmaları için IVM ve PERSONEL uygulama açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde birden çok kritik adım vardır. İlk olarak, karaciğerintravital görüntüleme sırasında hareket en aza indirilmesi PERSONEL kullanarak kılcal akış analizi için kullanılabilir filmler üretmek için gereklidir. Diyaframın yakınlığı nedeniyle, solunuma bağlı kısa süreli hareket oluşur ve güvenli karaciğer her nefesten sonra ilk pozisyonuna geri döner. Gazlı bez kullanarak kapak dipli çanak karşı cerrahi maruz karaciğer güvenliğini, daha sonra ters mikroskop kullanarak aşağıd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada sunulan çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH U01 GM111243 ve NIH NIDDK P30 DK079312) tarafından desteklenmiştir. Indiana Biyolojik Mikroskobu Merkezi’nde intravital mikroskopi çalışmaları yapılmıştır. Dr. Malgorzata Kamocka’ya mikroskopi konusunda teknik yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
Referências
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -. L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
