Quantitative Messung von intrathecally Synthetisierten Proteinen bei Mäusen
Summary
Erhöhte Spinalflüssigkeitsproteinspiegel können entweder das Ergebnis der Diffusion von Plasmaprotein über eine veränderte Blut-Hirn-Schranke oder intrathekale Synthese sein. In diesem Artikel wird ein optimiertes Testprotokoll vorgestellt, das hilft, beide Fälle zu unterscheiden und quantitative Messungen von intrathekalen synthetisierten Proteinen liefert.
Abstract
Cerebrospinalfluid (CSF), eine Flüssigkeit im Gehirn und im Rückenmark gefunden, ist von großer Bedeutung für die grundlegende und klinische Wissenschaft. Die Analyse der CSF-Proteinzusammensetzung liefert wichtige Informationen in der grundlagenspezifischen neurowissenschaftlichen Forschung sowie neurologischen Erkrankungen. Eine Einschränkung besteht darin, dass Proteine, die in CSF gemessen werden, sowohl aus der intrathekalen Synthese als auch aus der Transudation aus Serum stammen können, und die Proteinanalyse von CSF kann nur die Summe dieser beiden Komponenten bestimmen. Um zwischen Proteintransudation aus dem Blut und intrathekal produzierten Proteinen in Tiermodellen sowie beim Menschen zu unterscheiden, müssen CSF-Proteinprofilierungsmessungen mit herkömmlichen Proteinanalysewerkzeugen die Berechnung des Albumin-CSF/Serumquotienten(Q-Albumin), eines Markers für die Integrität der Blut-Hirn-Schnittstelle (BBI) und des Proteinindex (Q-Protein/Q-Albumin ), eine Schätzung der intrathekalen Proteinsynthese umfassen. Dieses Protokoll veranschaulicht das gesamte Verfahren, von der CSF- und Blutentnahme bis hin zu Quotienten und Indexberechnungen, zur quantitativen Messung der intrathekalen Proteinsynthese und BBI-Beeinträchtigung in Mausmodellen neurologischer Störungen.
Introduction
Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), eine klare und farblose Flüssigkeit, die das Gehirn und das Rückenmark umgibt, hat eine große klinische und grundlegende wissenschaftliche Bedeutung. Das CSF bewahrt die elektrolytische Umgebung des Zentralnervensystems (ZNS), gleicht den systemischen Säure-Basenstatus aus, versorgt neuronale und gliale Zellen mit Nährstoffen, fungiert als Lymphsystem für das ZNS und transportiert Hormone, Neurotransmitter, Zytokine und andere Neuropeptide durch das ZNS1. Da die CSF-Zusammensetzung die Aktivität des ZNS widerspiegelt, bietet diese Flüssigkeit einen wertvollen, wenn auch indirekten Zugang, um den physiologischen und pathologischen Zustand des ZNS zu charakterisieren.
CSF wurde verwendet, um Bedingungen zu diagnostizieren, die das ZNS seit über hundert Jahren beeinflussen, und für die meiste Zeit wurde es in erster Linie von Ärzten als diagnostisches Werkzeug untersucht. In den letzten Jahren haben Neurobiologen jedoch das Potenzial von CSF für die Untersuchung der Pathophysiologie des ZNS erkannt. Insbesondere wurden im bereich der Neurowissenschaften mehrere Werkzeuge zur Proteinanalyse mit hohem Durchsatz eingeführt, die eine detaillierte Untersuchung der Proteinzusammensetzung des GFK ermöglichen, mit der Erwartung, dass diese Analyse dazu beitragen kann, Einblicke in die dynamischen Veränderungen zu geben. innerhalb des CNS auftreten.
Technologische Entwicklungen in Multiplex-Immunoassay-Techniken wie Luminex und Simoa-Technologien2,3, bieten Forschern heute die Möglichkeit, Hunderte von Proteinen in sehr niedrigen Konzentrationen zu erkennen. Darüber hinaus ermöglichen dieselben Technologien die Verwendung kleiner Probenvolumina und fördern damit Studien an Kleintieren, einschließlich Mäusen, bei denen begrenzte Probenmengen von GFK bis vor kurzem detaillierte Charakterisierungen der Flüssigkeit verhindert haben.
Eine Einschränkung ist jedoch, dass Proteine, die in CSF gemessen werden, aufgrund einer beschädigten Blut-Hirn-Schnittstelle (BBI) aus der intrathekalen Synthese und/oder Transudation aus Serum stammen können. Leider kann die Proteinanalyse von CSF allein nur die Summe dieser beiden Komponenten bestimmen. Um zwischen transudate und intrathecally produzierten Proteinen zu unterscheiden, müssen CSF-Proteinmessungen mit einem verfügbaren Proteinanalyse-Tool an die individuelle Variabilität der Serumkonzentrationen sowie die Barriereintegrität angepasst werden. Obwohl diese Anpassung häufig in der klinischen Praxis verwendet wird, z. B. der CSF-IgG-Index, der eine hohe Empfindlichkeit für den Nachweis der intrathekalen IgG-Synthese4,5,6hat bisher nur sehr wenige Studien die CSF-Proteinkonzentrationen für die Serumkonzentration und Barriereintegrität korrigiert7,8.
Derzeit ist der Reibergram-Ansatz der beste Weg, um die Barrierefunktion und intrathekale Synthese von Proteinen zu bestimmen. Es handelt sich um eine grafische Auswertung in CSF/Serumquotientendiagrammen, die auf integrierte Weise sowohl die Barrierefunktion (Dys)-Funktion als auch die intrathekale Proteinsynthese analysiert und sich auf ein ausschließlich blutabgeleitetes Protein9,10bezieht. Das reichlich reichlich eiternreiche Proteinalbumin wird in der Regel als Referenzprotein ausgewählt, da es nur in der Leber produziert wird und weil seine Größe, ca. 70 kDa, zwischen kleinen und großen Proteinen11liegt. Das Analysediagramm wurde erstmals 1987 von Reiber und Felgenhauer für die wichtigsten Klassen von Immunglobulinen (Igs)11definiert, wobei empirisch auf den Ergebnissen aus der Analyse tausender menschlicher Proben9. Der Ansatz wurde später durch die Anwendung der beiden Fick-Gesetze der Diffusion in der Theorie der molekularen Diffusion/Durchflussrate12bestätigt. Eine solche Theorie zeigt die Diffusion eines Proteins durch die Barriere hat eine hyperbolische Verteilung und kann quantitativ die Dynamik von Proteinen in der ZNS9,13erklären. Insgesamt besteht der Vorteil der Verwendung des Reibergram zum Nachweis der intrathekalen Proteinsynthese darin, dass es gleichzeitig die Proteinfraktion identifiziert, die aus dem Serum in das CSF gelangt, sowie die Menge an Protein, die im CSF aufgrund der lokalen Produktion gefunden wird.
Der vorliegende Artikel und das zugehörige Protokoll beschreiben das gesamte Verfahren, von der CSF- und Blutentnahme bis zu den endgültigen Berechnungen zur Korrektur des CSF-Proteinspiegels, für die quantitative Messung der intrathekalen Proteinsynthese in Mausmodellen neurologischer Störungen. Dieses Verfahren bietet eine Ausgangsbasis, anhand derer (1) der pathophysiologische Ursprung eines CSF-Proteins und (2) die Stabilität und funktionelle Bedeutung der Barriereintegrität beurteilt werden können. Dieses Verfahren und Protokoll sind nicht nur nützlich für die Beurteilung von Maus-CSF-Proben, sondern auch nützlich bei der Analyse von CSF in einer Vielzahl von Tiermodellen von neurologischen Erkrankungen und menschlichen Patienten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantitative Methoden zur Bewertung erhöhter CSF-Proteinkonzentrationen sind nützliche Werkzeuge zur Charakterisierung des physiologischen und pathologischen Zustands des ZNS. Über die zuverlässige Quantifizierung des CSF-Proteinspiegels hinaus erfordert der Nachweis von CSF-Proteinen jedoch eine Expression von Ergebnissen, die zwischen blut- und zNS-abgeleiteten Fraktionen im CSF unterscheiden. Bislang erlauben die häufig verwendeten Proteinquantifizierungstests jedoch keine Diskriminierung zwischen den beiden Prot…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitarbeitern des Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) in Dartmouth für ihre fachkundige Betreuung der Mäuse, die für diese Studien verwendet werden. Der Bornsteiner Forschungsfonds finanzierte diese Forschung.
Materials
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
Referências
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