चूहों में इंट्राथेकैली संश्लेषित प्रोटीन का मात्रात्मक माप
Summary
ऊंचा रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ प्रोटीन का स्तर या तो एक बदल रक्त मस्तिष्क बाधा या इंट्राथेकल संश्लेषण भर में प्लाज्मा प्रोटीन के प्रसार का परिणाम हो सकता है । इस लेख में एक अनुकूलित परीक्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो दोनों मामलों को भेदभाव करने में मदद करता है और इंट्राथेकैली संश्लेषित प्रोटीन के मात्रात्मक माप प्रदान करता है।
Abstract
मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में पाया जाने वाला तरल पदार्थ सेरेब्रोस्पाइनल फ्लूइड (सीएसएफ) बुनियादी और नैदानिक विज्ञान दोनों के लिए बहुत महत्वरखपूर्ण है। सीएसएफ प्रोटीन संरचना का विश्लेषण बुनियादी तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के साथ-साथ न्यूरोलॉजिकल रोगों में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है। एक चेतावनी यह है कि सीएसएफ में मापा गया प्रोटीन सीरम से इंट्राथेकल संश्लेषण और ट्रांस्युरेशन दोनों से प्राप्त हो सकता है, और सीएसएफ का प्रोटीन विश्लेषण केवल इन दो घटकों का योग निर्धारित कर सकता है। रक्त और इंट्राथेकैली से प्रोटीन ट्रांसुएशन के बीच भेदभाव करने के लिए पशु मॉडल ों के साथ-साथ मनुष्यों में प्रोटीन का उत्पादन किया जाता है, पारंपरिक प्रोटीन विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करके सीएसएफ प्रोटीन प्रोफाइलिंग मापमें एल्बुमिन सीएसएफ/सीरम भागफल (क्यूएल्बुमिन),रक्त-मस्तिष्क इंटरफेस (बीबीआई) की अखंडता का एक मार्कर, और प्रोटीन इंडेक्स (क्यूप्रोटीन/क्यूएल्बुमिन),इंट्राथेलिन प्रोटीन का अनुमान शामिल होना चाहिए । यह प्रोटोकॉल न्यूरोलॉजिकल विकारों के माउस मॉडल में इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण और बीबीआई हानि के मात्रात्मक माप के लिए सीएसएफ और रक्त संग्रह से लेकर भागफल और सूचकांकों की गणना तक पूरी प्रक्रिया को दर्शाता है।
Introduction
मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के आसपास एक स्पष्ट और बेरंग तरल सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (सीएसएफ) महान नैदानिक और बुनियादी वैज्ञानिक महत्व रखता है। सीएसएफ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के इलेक्ट्रोलाइटिक वातावरण को बरकरार रखता है, प्रणालीगत एसिड-आधार स्थिति को संतुलित करता है, न्यूरोनल और ग्लियल कोशिकाओं को पोषक तत्वों की आपूर्ति करता है, सीएनएस के लिए एक लिम्फेटिक सिस्टम के रूप में कार्य करता है, और सीएनएस1में हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर, साइटोकिन्स और अन्य न्यूरोपेप्टाइड्स का परिवहन करता है। इस प्रकार, चूंकि सीएसएफ संरचना सीएनएस की गतिविधि को दर्शाती है, यह तरल पदार्थ एक मूल्यवान प्रदान करता है, हालांकि अप्रत्यक्ष रूप से, सीएनएस के शारीरिक और रोग राज्य की विशेषता के लिए पहुंच।
सीएसएफ का उपयोग उन स्थितियों का निदान करने के लिए किया गया है जो सौ से अधिक वर्षों तक सीएनएस को प्रभावित करती हैं, और अधिकांश समय के लिए, इसका मुख्य रूप से चिकित्सकों द्वारा एक नैदानिक उपकरण के रूप में अध्ययन किया गया था। हालांकि, हाल के वर्षों में न्यूरोबायोलॉजिस्ट ने सीएनएस के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए सीएसएफ की क्षमता को पहचाना है। विशेष रूप से, सीएसएफ की प्रोटीन संरचना के विस्तृत अध्ययन की अनुमति देने वाले तंत्रिका विज्ञान दायरे में कई उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन विश्लेषण उपकरण पेश किए गए हैं, इस उम्मीद के साथ कि यह विश्लेषण गतिशील परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकता है सीएनएस के भीतर होने वाली।
ल्यूमिनेक्स और सिमोआ टेक्नोलॉजीज2,3जैसी मल्टीप्लेक्स इम्यूनोसे तकनीकों में तकनीकी विकास आज शोधकर्ताओं को बहुत कम सांद्रता पर सैकड़ों प्रोटीन का पता लगाने की क्षमता प्रदान करते हैं। इसके अलावा, ये एक ही प्रौद्योगिकियां छोटे नमूना मात्रा के उपयोग की अनुमति देती हैं, जिससे चूहों सहित छोटे जानवरों में अध्ययन को बढ़ावा मिलता है, जिसमें सीएसएफ के सीमित नमूना मात्रा ने हाल ही में जब तक तरल पदार्थ के विस्तृत लक्षण ों को पहले से ही किया है।
फिर भी, एक चेतावनी यह है कि सीएसएफ में मापा प्रोटीन एक क्षतिग्रस्त रक्त मस्तिष्क इंटरफेस (BBI) के कारण सीरम से इंट्राथेकल संश्लेषण और/या ट्रांसड्यूेशन से प्राप्त हो सकता है । दुर्भाग्य से, अकेले सीएसएफ का प्रोटीन विश्लेषण केवल इन दो घटकों का योग निर्धारित कर सकता है। ट्रांसड्यूडेट और इंट्राथेकैली उत्पादित प्रोटीन के बीच भेदभाव करने के लिए, सीएसएफ प्रोटीन माप किसी भी उपलब्ध प्रोटीन विश्लेषण उपकरण का उपयोग करसीरम सांद्रता में व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के साथ-साथ बाधा अखंडता के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। हालांकि, हालांकि इस समायोजन का उपयोग आमतौर पर नैदानिक अभ्यास में किया जाता है, उदाहरण के लिए, सीएसएफ आईजीजी इंडेक्स, जिसमें इंट्राथेकल आईजीजी संश्लेषण4,5,6का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता है, आज तक बहुत कम शोध अध्ययनों ने सीआरएफ प्रोटीन सांद्रता को सीरम एकाग्रता और बाधा अखंडता7,8के लिए सही किया है।
वर्तमान में, रेबर्गराम दृष्टिकोण प्रोटीन के बाधा समारोह और इंट्राथेकल संश्लेषण को निर्धारित करने का सबसे अच्छा तरीका है। यह सीएसएफ/सीरम भागफल आरेख में एक चित्रमय मूल्यांकन है जो एक एकीकृत तरीके से, बाधा (डीआईएस) कार्य और इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण दोनों का विश्लेषण करता है, जो विशेष रूप से रक्त-व्युत्पन्न प्रोटीन9,10का जिक्र करता है । अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन एल्बुमिन आमतौर पर संदर्भ प्रोटीन के रूप में चुना जाता है क्योंकि यह केवल जिगर में उत्पादित होता है और क्योंकि इसका आकार, लगभग 70 केडीए, छोटे और बड़े प्रोटीन11के बीच मध्यवर्ती होता है। विश्लेषण आरेख को पहली बार 1 9 87 में रीबर और फेल्गेनहॉयर द्वारा इम्यूनोग्लोबुलिन (आईजीएस)11की प्रमुख कक्षाओं के लिए परिभाषित किया गया था, जो हजारों मानव नमूनोंकेविश्लेषण से प्राप्त परिणामों के आधार पर अनुभवजन्य रूप से 9। बाद में आणविक प्रसार/प्रवाह दर12के सिद्धांत में प्रसार के दो Fick कानूनों के आवेदन से इस दृष्टिकोण की पुष्टि की गई । इस तरह के सिद्धांत से यह दर्शाता है कि बाधा के माध्यम से प्रोटीन के प्रसार में हाइपरबोलिक वितरण होता है और यह सीएनएस9,13में प्रोटीन की गतिशीलता को मात्रात्मक रूप से समझा सकता है । कुल मिलाकर, इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण का प्रदर्शन करने के लिए रीबर्गराम का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह समवर्ती रूप से प्रोटीन अंश की पहचान करता है जो सीआरएफ से सीएसएफ में प्रवेश करता है और साथ ही स्थानीय उत्पादन के कारण सीएसएफ में पाए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा भी।
वर्तमान लेख और संबंधित प्रोटोकॉल पूरी प्रक्रिया का वर्णन, सीएसएफ और रक्त संग्रह से अंतिम गणना के लिए सीएसएफ प्रोटीन के स्तर को सही, तंत्रिका विज्ञान के माउस मॉडल में इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण के मात्रात्मक माप के लिए विकारों. यह प्रक्रिया एक आधार रेखा प्रदान करती है जिसके खिलाफ किसी भी सीएसएफ प्रोटीन की रोगविज्ञानी उत्पत्ति का आकलन (1) और बाधा अखंडता की स्थिरता और कार्यात्मक महत्व ( 2) प्रदान करता है। यह प्रक्रिया और प्रोटोकॉल न केवल माउस सीएसएफ नमूनों का आकलन करने के लिए उपयोगी हैं बल्कि न्यूरोलॉजिकल रोगों और मानव रोगियों के पशु मॉडलों की एक भीड़ में सीएसएफ का विश्लेषण करने में भी उपयोगी हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएसएफ प्रोटीन सांद्रता के मूल्यांकन के लिए मात्रात्मक तरीके सीएनएस के शारीरिक और रोग राज्य के लक्षण वर्णन में उपयोगी उपकरण हैं। हालांकि, सीएसएफ प्रोटीन के स्तर के विश्वसनीय मात्राकरण से परे, सीएसएफ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल चूहों की अपनी विशेषज्ञ देखभाल के लिए डार्टमाउथ में तुलनात्मक चिकित्सा और अनुसंधान (CCMR) के लिए केंद्र के कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करते हैं । बोर्नस्टीन रिसर्च फंड ने इस शोध को वित्त पोषित किया ।
Materials
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
Referências
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