Medição quantitativa de proteínas sintetizadas intrathecally em camundongos

Summary

Níveis elevados de proteína do fluido espinhal podem ser o resultado da difusão da proteína plasmática através de uma barreira hemato-cerebral alterada ou síntese intratérica. Um protocolo de teste otimizado é apresentado neste artigo que ajuda a discriminar ambos os casos e fornece medições quantitativas de proteínas sintetizadas intrathecally.

Abstract

O líquido cefalorraquidiano (CSF), um fluido encontrado no cérebro e na medula espinhal, é de grande importância para a ciência básica e clínica. A análise da composição da proteína CSF fornece informações cruciais na pesquisa básica de neurociência, bem como doenças neurológicas. Uma ressalva é que as proteínas medidas em CSF podem derivar da síntese intrathecal e da transudação do soro, e a análise da proteína de CSF pode somente determinar a soma destes dois componentes. Para discriminar entre a transudação de proteínas do sangue e proteínas intrathecally produzidas em modelos animais, bem como em seres humanos, as medições de perfil de proteína CSF usando ferramentas convencionais de análise de proteínadevem incluir o cálculo do quociente de csf/soro albumina_{(q albumina),}um marcador da integridade da interface sangue-cérebro (BBI) e do índice de proteína_{(q proteína/q albumina}), uma estimativa de síntese de proteína intrathecal. Este protocolo ilustra todo o procedimento, desde csf e coleta de sangue para quocientes e cálculos de índices, para a medição quantitativa da síntese intratês de proteínas e imparidade BBI em modelos de camundongos de distúrbios neurológicos.

Introduction

O líquido cefalorraquidiano (CSF), um líquido claro e incolor em torno do cérebro e da medula espinhal, tem grande importância científica clínica e básica. O CSF preserva o ambiente eletrólitico do sistema nervoso central (SNC), equilibra o estado sistêmico de base ácida, fornece nutrientes para células neuronais e gliais, funciona como um sistema linfático para o SNC, e transporta hormônios, neurotransmissores, citocinas e outros neuropeptídeos em todo o CNS¹. Assim, como a composição do CSF reflete a atividade do SNC, esse fluido oferece um acesso valioso, embora indireto, para caracterizar o estado fisiológico e patológico do SNC.

A CSF tem sido usada para diagnosticar condições que afetam o SNC há mais de cem anos, e durante a maior parte desse tempo, foi estudada principalmente pelos clínicos como uma ferramenta de diagnóstico. No entanto, nos últimos anos, os neurobiólogos reconheceram o potencial da CSF para estudar a fisiopatologia do SNC. Em particular, várias ferramentas de análise de proteína de alta taxa de vesperção foram introduzidas no reino da neurociência, permitindo um estudo detalhado da composição proteica do CSF, com a expectativa de que esta análise possa ajudar a fornecer informações sobre as mudanças dinâmicas ocorrendo dentro do SNC.

Desenvolvimentos tecnológicos em técnicas de imunoensaio multiplex, como luminex e simoa tecnologias^2,3, fornecer pesquisadores hoje com a capacidade de detectar centenas de proteínas em concentrações muito baixas. Além disso, essas mesmas tecnologias permitem o uso de pequenos volumes de amostras, promovendo assim estudos em pequenos animais, incluindo camundongos, nos quais volumes de amostras limitados de CSF impediram caracterizações detalhadas do fluido até recentemente.

No entanto, uma ressalva é que as proteínas medidas em CSF podem derivar da síntese intrathecal e/ou transudação do soro devido a uma interface sangue-cérebro danificada (BBI). Infelizmente, a análise de proteínas da CSF por si só só pode determinar a soma desses dois componentes. Para discriminar entre proteínas produzidas transudate e intrathecally, as medidas da proteína de CSF usando toda a ferramenta disponível da análise da proteína devem ser ajustadas para a variabilidade individual em concentrações do soro assim como a integridade da barreira. No entanto, embora esse ajuste seja comumente usado na prática clínica, por exemplo, o índice CSF IgG, que tem alta sensibilidade para detectar a síntese intrathecal igg^4,5,6, até o momento, muito poucos estudos de pesquisa corrigiram concentrações de proteína CSF para concentração de soro e integridade de barreira^7,8.

Atualmente, a abordagem Reibergram é a melhor maneira de determinar a função de barreira e síntese intratérica de proteínas. É uma avaliação gráfica em diagramas quocientes csf/sérico que analisa, de forma integrada, tanto a função de barreira (dys) quanto a síntese intratais de proteínas, referindo-se a uma proteína exclusivamente derivada do sangue^9,10. A albumina de proteína altamente abundante é geralmente escolhida como proteína de referência porque é produzida apenas no fígado e porque seu tamanho, aproximadamente 70 kDa, é intermediário entre proteínas pequenas e grandes^11. O diagrama de análise foi definido pela primeira vez por Reiber e Felgenhauer em 1987 para as principais classes de imunoglobulinas (Igs)¹¹, sendo empiricamente com base nos resultados obtidos a partir da análise de milhares de amostras humanas⁹. A abordagem foi posteriormente confirmada pela aplicação das duas leis de difusão de Fick na teoria da difusão molecular/taxa de fluxo¹². Tal teoria demonstra que a difusão de uma proteína através da barreira tem uma distribuição hiperbólica e pode explicar quantitativamente a dinâmica das proteínas no SNC^9,13. No geral, a vantagem de usar o Reibergram para demonstrar a síntese intrathecal de proteínaé que ela identifica simultaneamente a fração de proteína que entra no CSF do soro, bem como a quantidade de proteína encontrada no CSF por causa da produção local.

O presente artigo e o protocolo relacionado descrevem todo o procedimento, desde csf e coleta de sangue até os cálculos finais corrigindo os níveis de proteína CSF, para a medição quantitativa da síntese intrathecal de proteínas em modelos de camundongos de Distúrbios. Este procedimento fornece uma linha de base contra a qual avaliar (1) a origem fisiopatológica de qualquer proteína CSF e (2) a estabilidade e o significado funcional da integridade da barreira. Este procedimento e protocolo não são apenas úteis para avaliar amostras de CSF de camundongos, mas também são úteis na análise de CSF em uma infinidade de modelos animais de doenças neurológicas e pacientes humanos.

Protocol

Todo o trabalho animal utiliza protocolos revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Geisel School of Medicine em Dartmouth. 1. Coleta de fluidos NOTA: Tanto o soro quanto o CSF são necessários. Dois protocolos para cada coleta de fluidos são necessários para a sobrevivência e necropsia. Coleta de soro e CSF usando procedimentos de sobrevivênciaNOTA: Para a coleta de fluidos de sobrevivência, a coleta de so…

Representative Results

Este experimento representativo teve como objetivo comparar a síntese intratítica do IgG em dois modelos de roedores clinicamente relevantes de esclerose múltipla (EM): a PLP139-151-induzida pela encefalomielite autoimune experimental (TMEV-IDD) e a doença de desmielinação induzida pelo vírus de Theiler. R-EAE é um modelo útil para a compreensão de EmS remitindo-remitindo-remitindo, visto que o modelo de TMEV-IDD caracteriza oM9progressivo crônico. <p class="jove_content"…

Discussion

Métodos quantitativos para a avaliação do aumento das concentrações de proteínas CSF são ferramentas úteis na caracterização do estado fisiológico e patológico do SNC. No entanto, além da quantificação confiável dos níveis de proteína CSF, a detecção de proteínas CSF requer uma expressão de resultados que discrimina entre frações derivadas do sangue e do SNC no CSF. No entanto, até à data, os ensaios de quantificação de proteínas comumente utilizados não permitem a discriminação entre os d…

Materials

1 mL insulin syringe	BD	329650
1 mL syringe	BD	329622
25 gauge needle	BD	305122
3 mL syringe	BD	309582
30 gauge insulin needle	BD	305106
Absorbent pads	Any suitable brand
Acepromazine	Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer	BioRad	171020100	Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad	171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates	BioRad	171025001
Biotinilated detection antibody	Any suitable source		The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A4503
Buprenorphine hydrochloride	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
Capillary Tubes	Sutter Instrument	B100-75-10	OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL	VWR	20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL	VWR	87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL	VWR	87003-294
Chlorhexidine diacetate	Nolvasan	E004272
Disposable pipettes tips	Any suitable brand
Ear bars	KOPF Instruments	1921 or 1922
Ethanol	Kopter	V1001
Freezer	VWR	VWR32086A
Gauze	Medline	NON25212
Heating pad	Sunbeam		XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber	VETEQUIP
Isoflurane	Patterson Vet Supply Inc	NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed)	Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled)	BioRad		Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker	Southwest Scientific	SBT1500
Microretractors	Carfill Quality	ACD-010	Blunt – 1 mm
Microsoft Office (Excel)	Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel	EMD Millipore	MGAMMAG-300K	Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit	Novus Biological	NBP2-60484	Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000060
Non-Sterile swabs	MediChoice	WOD1002	Need to be autoclaved for sterility
Oxygen	AIRGAS	OX USPEA
Pasteur Pippettes	Fisher	13-678-20A	5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen	Patterson Vet	8695G	P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin	BD Biosciences	554061
Pipetters	Eppendorf	Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	ALLEGRA X-12R
Scale	Uline	H2716
Scalpel	Feather	EF7281
Shaver	Harvard Apparatus	52-5204
Standard proteins	Any suitable source		The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument	KOPF Instruments	Model 900LS	Standard Accessories
Sterile 1 x PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
Sterile saline	Baxter	0338-0048-02	0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2)	Fine Science Tools	11271-30	Dumont
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14094-11	Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter	Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex	Fisher	02-215-414
Warming pad	Kent Scientific Corporation	RT-JR-20
Water Sonicator	Cole Parmer	EW-08895-01
Xylazine	Patterson Vet Supply Inc