Helmonterad in situ-hybridisering i Zebrafish Embryon och Tube Formation Assay i iPSC-ECs att studera rollen av Endoglin i vaskulär utveckling
Summary
Presenteras här är ett protokoll för hela montera in situ RNA hybridisering analys i zebrafish och rör bildning analys i patient-härledda inducerad pluripotenta stamceller-härledda endotelceller att studera rollen av endoglin i vaskulär bildning.
Abstract
Vaskulär utveckling bestäms av det sekventiella uttrycket av specifika gener, som kan studeras genom att utföra in situ hybridiseringsanalyser i zebrafiskar under olika utvecklingsstadier. För att undersöka rollen av endoglin (eng) i fartygsbildning under utvecklingen av ärftlig hemorragisk telangiectasia (HHT), används morpholino-medierad riktad knockdown av eng i zebrafiskar för att studera dess temporala uttryck och associerade funktioner. Här används helmonterad in situ RNA-hybridisering (WISH) för analys av eng och dess nedströmsgener i zebrafiskembryon. Dessutom utförs rörbildningsanalyser i HHT patient-härledda inducerad pluripotenta stamceller differentierade endotelceller (iPSC-ECs; med eng mutationer). Ett specifikt signalförstärkningssystem med hela beloppet In Situ Hybridization – WISH ger högre upplösning och lägre bakgrundsresultat jämfört med traditionella metoder. För att få en bättre signal justeras efterfixeringstiden till 30 minuter efter sondhybritisering. Eftersom fluorescensfärgning inte är känslig i zebrafiskembryon ersätts den med diaminobezidin (DAB) färgning här. I detta protokoll, HHT patient-härledda iPSC linjer som innehåller en eng mutation differentieras till endotelceller. Efter beläggning av en platta med källarmembranmatris i 30 min vid 37 °C, sådds iPSC-ECs som en monolager i brunnar och hålls vid 37 °C i 3 timmar. Sedan beräknas rörets längd och antal grenar med hjälp av mikroskopiska bilder. Således, med denna förbättrade WISH protokoll, det visas att minskad eng uttryck påverkar endotel stamfader bildning i zebrafisk embryon. Detta bekräftas ytterligare av rörbildningsanalyser med hjälp av iPSC-ECs som härrör från en patient med HHT. Dessa analyser bekräftar rollen för eng i tidig vaskulär utveckling.
Introduction
En enda mutation på eng (CD105) har rapporterats hos patienter med HHT. Mutationen leder till ökad EG-spridning och minskad flödesmedierad EG-förlängning1,,2. Det har också tidigare rapporterats att ENG-brist minskar endotel markörer uttryck (dvs kdrl, cdh5, hey2) i zebrafish3. Endoglin, främst uttryckt i endotelceller, är ett transmembrane glykoprotein och fungerar som en co-receptor för att omvandla tillväxtfaktor β (TGF-β) familjemedlemmar. Det riktar BMP9 bindning på cellytan för att reglera nedströms gen, inklusive Id1 uttryck, att inducera stamceller differentiering mot ECs4. Således spelar eng genen viktiga roller i vaskulogenes och mänskliga kärlsjukdom5,6. Vi har tidigare undersökt effekterna av endoglin knockdown på fartygsbildning i zebrafisk embryon, följt av analys av iPSCs-härledda ECs förvärvats från en HHT patient med en eng mutation7. Detta protokoll visar effekterna av ENG brist på endotel stamfader markör uttryck och rör bildning, som är en kvantifierbar metod för att mäta in vitro angiogenes.
För att studera eng rumsliga och tidsmässiga uttryck, är WISH används för att upptäcka genuttryck in vivo8. In situ hybridisering (ISH) är en metod för att använda märkta sonder med komplementsekvenser av mål nukleinsyror (DNA eller mRNA) för att upptäcka och visualisera mål nukleinsyrhybrider i ett fast exemplar. Processen förstärker genuttryckssignaler in vivo och används för att detektera genernas uttryck genom mikroskopi. WISH har använts i stor utsträckning i olika modelldjur, särskilt i zebrafisk9. Det används också för att förvärva följande data: 1) gen spatial /temporal uttryck mönster, som ger information om genfunktion och klassificering; och 2) specifikt uttryckta genmarkörer som används vid hög genomströmningsläkemedel eller mutantscreening10.
Kromogena sonder bryts lätt ned med traditionell kromosom in situ-hybridisering (CISH), vilket resulterar i högt bakgrundsljud och ospecificerad signaler11,12. WISH-metoden använder två oberoende dubbla Z-sonder, som är utformade för att hybridisera för att rikta RNA-sekvenser. Varje sond innehåller en 18-25 sekvens som kompletterar mål-RNA och en 14-bassvansekvens (konceptualiserad som Z). Målsonderna används i ett par (dubbla Z). De två svanssekvenserna bildar tillsammans en 28-bashybridiseringsplats för förförstärkaren, som innehåller 20 bindningsställen för förstärkaren. Förstärkaren innehåller i sin tur 20 bindningsställen för etikettsonden och kan teoretiskt ge upp till 8 000 etiketter för varje mål-RNA-sekvens.
Denna avancerade teknik underlättar samtidig signalförstärkning och bakgrundsdämpning för att uppnå single-molekyl visualisering samtidigt som vävnad morfologi13. Ytterligare modifiering av WISH-metoderna baseras på tidigare forskning14, inklusive extra fixering och DAB-färgning. Finns här är ett förbättrat WISH-protokoll som kan fungera även om mål-RNA delvis minskas eller försämras. Fördelarna inkluderar att det kan slutföras i 24 h utan RNase-fria förhållanden. Signaler kan också samtidigt upptäckas via flera kanaler från flera mål, och resultaten är konsekventa och kompatibla med resultat från olika automatiseringsplattformar med hög genomströmning.
Resultat från djurmodeller återspeglar inte samma fenomen som förekommer hos människor. ENG innehåller två par bevarade cysteiner, C30-C207 och C53-C182, som bildar disulfid broar i föräldralösa regioner. För att ytterligare studera rollen som eng hos HHT-patienter har rörbildningsanalyser med iPSC-patienter som härrör från HHT-patienter utförts i celler utan/med engmutationer (Cys30Arg, C30R)15. Efter Kubota et al. först rapporterade röret bildandet experiment16, analysen har utvecklats på flera sätt. Det har använts för att identifiera angiogena eller antiangiogenic faktorer, definiera signalering vägar i angiogenes, och identifiera gener som reglerar angiogenes17.
Före tillgången på patientbaserade iPSC-ECs använde forskare främst odlade ECs för att studera angiogens16. Men för endotelceller är det en teknisk utmaning att transducea exogena gener med ett virus, på grund av det begränsade passagenummer som ECs kan genomgå. Detta beror på att det knappast finns tillräckligt med cellmaterial som ska samlas in från mänskliga fartyg antingen från kirurgi eller matchade godkända givare. Med uppfinningen av iPSC generation teknik av Shinya Yamanaka, mänskliga ECs härrör från iPSCs kan användas tillförlitligt i in vitro-experiment, som rapporterats tidigare18.
Använda viralt omdanade ECs med begränsat antal och passager kan vara tillräckligt för signalering studier, men för funktionella studier, är det bättre att generera mutant pluripotenta stamcellslinjer, (antingen iPSCs eller CRISPER/Cas9-riktade hESCs), sedan differentiera dem till ECs för angiogenes studier som använder rörbildning analyser19. Rörbildning kan användas för att utvärdera funktionen hos endotelceller med mutationer. Detta protokoll beskriver också rörbildning på en μ-slide angiogenesplatta, vilket är en enkel, kostnadseffektiv och reproducerbar metod.
Protokollet nedan ger en tillförlitlig och systemisk metod för att studera betydelsen av specifika gener i vaskulär bildning, tillsammans med detaljer för in vivo uttryck mönster och in vitro funktionell kvantifiering för modellering av sjukdomar hos människor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll tillämpas en förbättrad hel-mount in situ RNA analysplattform för zebrafish och rör formation analyser på iPSC-ECs härrör från en HHT patient. Den traditionella ISH-metoden kräver en längre experimentell cykel med extra experimentella steg. Protokollet har några viktiga förbättringar, användning av oberoende dubbla Z sonder och iPSCs härrör från en patient med HHT som tillämpades i WISH analyser och rörbildning, respektive. Dessa förbättringar är avgörande för att öka detektionsk…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från National Key Research and Development Program of China-stem cell and translational research [grant number 2016YFA0102300 (to Jun Yang)];Nature Science Foundation of China [grant number 81870051, 81670054 (to Jun Yang)]; CAMS Innovationsfond för medicinska vetenskaper (CIFMS) [bidragsnummer 2016-I2M-4-003 (till Jun Yang)]; pumc-ungdomarna och grundforskningsfonderna för de centrala universiteten [bidragsnummer 2017310013 (till Fang Zhou)].
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
Referências
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish – implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Biologia do Desenvolvimento. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
