Helmontering i Situ Hybridisering i sebrafisk embryoer og tube formasjonsanalyse i iPSC-ECs å studere rollen som Endoglin i vaskulær utvikling

Summary

Presentert her er en protokoll for hel-mount in situ RNA hybridisering analyse i sebrafisk og rør formasjon analyse i pasient-avledet indusert pluripotent stamcelle-avledede endotelceller å studere rollen som endoglin i vaskulær formasjon.

Abstract

Vaskulær utvikling bestemmes av det sekvensielle uttrykket av spesifikke gener, som kan studeres ved å utføre in situ hybridiseringsanalyser i sebrafisk under ulike utviklingsstadier. For å undersøke rollen som endoglin(eng) i skipsdannelse under utviklingen av arvelig hemorragisk telangiectasia (HHT), brukes morpholino-mediert målrettet knockdown av eng i sebrafisk til å studere sitt temporale uttrykk og tilhørende funksjoner. Her er helmontert in situ RNA hybridisering (WISH) ansatt for analyse av eng og dets nedstrøms gener i sebrafiskembryoer. Også rørdannelsesanalyser utføres i HHT pasientavledede indusert pluripotent stamcelledifferensierte endotelceller (iPSC-ECer; med eng mutasjoner). Et spesifikt signalforsterkende system ved hjelp av hele beløpet In Situ Hybridization – WISH gir høyere oppløsning og lavere bakgrunnsresultater sammenlignet med tradisjonelle metoder. For å få et bedre signal, justeres etterløsningstiden til 30 minutter etter sondehybridisering. Fordi fluorescensfarging ikke er følsom i sebrafiskembryoer, erstattes den med diaminobezidin (DAB) farging her. I denne protokollen differensieres HHT pasientavledede iPSC-linjer som inneholder en eng-mutasjon, til endotelceller. Etter å ha dekket en plate med kjellermembranmatrise i 30 min ved 37 °C, seedes iPSC-ECer som monolager i brønner og oppbevares ved 37 °C i 3 timer. Deretter beregnes rørlengden og antall grener ved hjelp av mikroskopiske bilder. Dermed, med denne forbedrede WISH-protokollen, er det vist at redusert eng-uttrykk påvirker endotelstamdannelse i sebrafiskembryoer. Dette bekreftes videre av rørdannelsesanalyser ved hjelp av iPSC-ECer avledet fra en pasient med HHT. Disse analysene bekrefter rollen for eng i tidlig vaskulær utvikling.

Introduction

En enkelt mutasjon på eng (CD105) er rapportert hos pasienter med HHT. Mutasjonen fører til økt EF-spredning og redusert strømningsmediert EC-forlengelse^1,,2. Det har også tidligere blitt rapportert at ENG-mangel reduserer endotelmarkører uttrykk (dvs. kdrl, cdh5, hey2) i sebrafisk³. Endoglin, hovedsakelig uttrykt i endotelceller, er en transmembrane glykoprotein og fungerer som en co-reseptor for å transformere vekstfaktor β (TGF-β) familiemedlemmer. Det leder BMP9 binding på celleoverflaten for å regulere nedstrøms genet, inkludert Id1 uttrykk, å indusere stamcelle differensiering mot ECs⁴. Dermed spiller eng genet viktige roller i vaskuogenese og menneskelig vaskulær sykdom^5,6. Vi har tidligere undersøkt effekten av endoglin knockdown på fartøydannelse i sebrafisk embryoer, etterfulgt av analyse av iPSCs-avledet ECs ervervet fra en HHT pasient bærer en eng mutasjon⁷. Denne protokollen viser effekten av ENG-mangel på endotelstammarkøruttrykk og rørdannelse, som er en kvantifiserbar metode for måling av in vitro angiogenese.

For å studere eng romlig og timelig uttrykk, er WISH ansatt for å oppdage genuttrykk in vivo⁸. In situ hybridization (ISH) er en metode for å bruke merkede sonder med komplement sekvenser av målkjernesyrer (DNA eller mRNA) for å oppdage og visualisere målkjernesyre hybrider i en fast prøve. Prosessen forsterker genuttrykkssignaler in vivo og brukes til å oppdage uttrykket av gener ved mikroskopi. WISH har vært mye brukt i ulike modell dyr, spesielt i sebrafisk⁹. Det brukes også til å skaffe følgende data: 1) gen romlige / temporale uttrykksmønstre, som gir informasjon om genfunksjon og klassifisering; og 2) spesielt uttrykte genmarkører som brukes i høygjennomstrømning narkotika eller mutant screening¹⁰.

Kromogene sonder er lett degradert med tradisjonelle kromosom in situ hybridization (CISH), noe som resulterer i høy bakgrunnsstøy og uspesifikke signaler^11,12. WISH-metoden bruker to uavhengige doble Z-sonder, som er designet for å hybridisere for å målrette RNA-sekvenser. Hver sonde inneholder en 18-25 sekvens komplementær til målet RNA og en 14 base tail sekvens (konseptualisert som Z). Målsondene brukes i et par (dobbel Z). De to halesekvensene danner sammen et 28-base hybridiseringssted for foramplifieren, som inneholder 20 bindingssteder for forsterkeren. Forsterkeren inneholder i sin tur 20 bindingssteder for etikettsonden og kan teoretisk gi opptil 8000 etiketter for hver mål RNA-sekvens.

Denne avanserte teknologien forenkler samtidig signalforsterkning og bakgrunnsundertrykkelse for å oppnå visualisering med ett molekyl samtidig som vevmorfologien^{bevares 13}. Ytterligere endring av WISH-metodene er basert på tidligere forskning¹⁴, inkludert ekstra fiksering og DAB-farging. Forutsatt her er en forbedret WISH-protokoll som kan fungere selv om målet RNA er delvis redusert eller degradert. Fordeler inkluderer at det kan fullføres i 24 timer uten RNase-frie forhold. Signaler kan også oppdages samtidig gjennom flere kanaler fra flere mål, og resultatene er konsistente og kompatible med resultater fra forskjellige automatiseringsplattformer med høy gjennomstrømning.

Resultater fra dyremodeller gjenspeiler ikke det samme fenomenet som oppstår hos mennesker. ENG inneholder to par bevarte cysteiner, C30-C207 og C53-C182, som danner disulfidbroer i foreldreløse områder. For ytterligere å studere rollen som eng hos HHT-pasienter, har rørdannelsesanalyser med iPSCer avledet fra HHT-pasienter blitt utført i celler uten/med eng-mutasjoner (Cys30Arg, C30R)¹⁵. Etter at Kubota et al. først rapporterte rørdannelseseksperimentet^16,er analysen utviklet på flere måter. Det har blitt brukt til å identifisere angiogene eller antiangiogene faktorer, definere signalveiene i angiogenese, og identifisere gener som regulerer angiogenese¹⁷.

Før tilgjengeligheten av pasientavledede iPSC-ECer, brukte forskere primært kultiverte ECer til å studere angiogensis¹⁶. Men for endotelceller er det en teknisk utfordring å transduce eksogene gener med et virus, på grunn av det begrensede passasjenummeret som ECer kan gjennomgå. Dette er fordi det er knapt nok cellulært materiale til å bli samlet inn fra menneskelige fartøy enten fra kirurgi eller matchet godkjente givere. Med oppfinnelsen av iPSC generasjon teknikk av Shinya Yamanaka, menneskelige ECer avledet fra iPSCs kan brukes pålitelig i in vitro eksperimenter, som rapportert tidligere¹⁸.

Ved hjelp av viralt transduserte ECer med begrenset antall og passasjer kan være tilstrekkelig for signalstudier, men for funksjonelle studier er det bedre å generere muterte pluripotente stamcellelinjer (enten iPSCer eller CRISPER / Cas9-målrettede hESCer), og deretter skille dem inn i ECer for angiogenesestudier som bruker rørdannelsesanalyser¹⁹. Rørdannelse kan brukes til å evaluere funksjonen til endotelceller som bærer mutasjoner. Denne protokollen beskriver også rørdannelse på en μ-slide angiogenese plate, som er en enkel, kostnadseffektiv og reproduserbar metode.

Protokollen nedenfor gir en pålitelig og systemisk metode for å studere rollen som spesifikke gener i vaskulær formasjon, sammen med detaljer for in vivo uttrykksmønster og in vitro funksjonell kvantifisering for modellering av menneskelig sykdom.

Protocol

Alle dyreforsøk som ble beskrevet ble godkjent av Forskningsetikkkomiteen ved Zhejiang University school of Medicine. 1. Helmontering in situ hybridisering Sebrafisk linje husdyrhold og reproduksjon Fôr og hev alle voksne sebrafisk ved 26-28 °C i et resirkulerende akvakultursystem med 14 t lys/10 t mørk syklus for hver dag. Bruk AB (wild-type) sebrafisk linjer for følgende prosedyrer. Legg et lag småstein i bunnen av avlsboksen som et ly for egg. Gruppe forel…

Representative Results

Hele mount in situ hybridization er basert på et prinsipp som ligner på fluorescens resonans energioverføring. Den er designet for å forbedre både følsomhet og spesifisitet i sebrafisk ISH samt forsterke målspesifikke signaler uten å påvirke bakgrunnssignalet. I 24 hpf sebrafisk embryoer, er endoglin sterkt uttrykt i den bakre kardinal vene (PCV), intersegmentale fartøy (ISVs), og blod øyer3…

Discussion

Denne protokollen brukte en forbedret helmontert in situ RNA-analyseplattform for sebrafisk- og rørdannelsesanalyser på iPSC-ECer avledet fra en HHT-pasient. Den tradisjonelle ISH-metoden krever en lengre eksperimentell syklus med ekstra eksperimentelle trinn. Protokollen har noen viktige forbedringer, bruk av uavhengige doble Z-sonder og iPSCer avledet fra en pasient med HHT som ble brukt i WISH-analyser og rørdannelse, henholdsvis. Disse forbedringene er avgjørende for å forbedre deteksjonsfølsomheten sammenligne…

Materials

µ-Slide Angiogenesis	ibidi	81506	Cell culture
Amp 1-FL	ACD	SDS 320852	Signal Amplification
Amp 2-FL	ACD	SDS 320853	Signal Amplification
Amp 3-FL	ACD	SDS 320854	Signal Amplification
Amp 4 Alt B-FL	ACD	SDS 320856	Signal Amplification
Corning Matrigel Matrix	Corning	354234	Growth factor-reduced Matrigel
DEPC	Sigma	D5758	RNAase-free Water
Human Endothelial-SFM	Thermofisher	11111044	Cell culture
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Fixed embryos
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Fixed Cells
Protease K	ACD	SDS 322337	Digest tissue
Sodium Citrate	Sigma	6132-04-3	SSCT solution: Wash Buffer
VEGF-165	STEMCELL Technologies	78073	Growth factor