엔터로이드에서 증식 및 죽은 세포의 정량화
Summary
제시된 프로토콜은 유세포측정을 사용하여 배양된 마우스 장용체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화합니다. 이 방법은 약물 치료가 오르가노이드 증식 및 생존에 미치는 영향을 평가하는 데 도움이 된다.
Abstract
장 상피는 병원성 미생물및 독소와 같은 발광 체질이 신체의 나머지 부분으로 들어가는 것을 방지하는 장벽 역할을합니다. 상피 장벽 기능은 장 상피 세포의 무결성을 필요로한다. 상피 세포 증식 장벽을 형성 하는 세포의 지속적인 층을 유지 하는 동안, 상피 손상 장벽 기능 장애에 이르게. 그 결과, 발광 내용물제한없는 통로를 통해 장 장벽을 가로 질러 수 있습니다. 장 장벽의 기능 장애는 염증성 장 질환과 같은 많은 장 질환과 관련이 있습니다. 고립 된 마우스 장 지하실배양 및 창 자-villus 같은 구조로 유지 될 수 있습니다., 장 오르가노이드 또는 “엔터 로이드”라고. 엔터로이드는 시험관 내에서 장 상피 세포의 증식 및 세포 사멸을 연구하는 데 이상적입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 배양된 장체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화하는 간단한 방법을 기술한다. 5-에티닐-2′-데옥시우리딘(EdU) 및 프로피듐 요오드화물은 장신구의 증식 및 죽은 세포에 라벨을 붙이기 위해 사용되며, 증식 및 죽은 세포의 비율은 유세포측정에 의해 분석됩니다. 이것은 장 상피 세포 증식 및 세포 생존에 대한 약물 치료의 효과를 테스트하는 유용한 도구입니다.
Introduction
장 상피 세포의 기본 기능은 병원성 박테리아 및 독소와 같은 발광 내용물의 진입을 보호하는 것입니다1,2. 이러한 기능을 수행하기 위해, 장줄기세포는 연속적으로 증식하고, 장세포 및 분비세포를 포함한 다양한 상피세포로 분화하며, 이는 단단한 연결을 형성하여 장벽을 형성한다3. 장 상피 세포의 급속한 갱신은 세포 증식, 세포 분화 및 세포 사멸의 엄격한조정을필요로4,5. 감소된 세포 증식 또는 과도한 세포 사멸은 상피 손상 및 손상된 장벽 기능1,6. 장 장벽의 기능 장애는 염증성 장 질환7,8과관련이 있습니다.
장 내 지하실을 배양하는 방법이 이전에 개발되었습니다. 이 기술을 사용하여, 고립 된 마우스 토굴은 구조와 같은 토굴 – 융모를 가지고 모든 장 상피 세포 계보를 포함하는 장 오르가노이드 (enteroids)로 성장,10. 5-에티닐-2′-데옥시우리딘(EdU)은 세포 증식 중에 복제를 받고 있는 DNA에서 티민(T)을 대체할 수 있는 티미딘 유사체이다. 증식 세포는 EdU 염색에 의해 신속하고 정확하게 표지될 수 있다. 프로피듐 요오드화물 (PI)는 이중 가닥 DNA로 삽입시 붉은 형광을 방출하는 에티듐 브로마이드의 유사체입니다. PI는 손상된 세포막을 통해서만 통과하기 때문에 죽은 세포를 구체적으로 감지합니다.
이 프로토콜에서는 먼저 무린 소장으로부터 토굴을 분리한 다음 시험관내 엔터로이드로 배양하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 EdU 및 PI 통합 및 유세포 분석에 의한 장신구의 증식 및 죽은 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 유세포측정에 의한 장내 EdU-및 PI 양성 세포의 시험관 내 및 정량화 및 엔테로이드의 배양에 필요한 단계를 상세히 설명한다. 이 전략에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, EdU 라벨링은 장체에서 증식 세포를 검출하는 데 사용됩니다. 기존의 BrdU 분석법에 비해 EdU 라벨링 방법은 더 빠르고 민감하며 더 정확합니다. EdU는 세포 분열 도중 DNA 종합에 있는 티민을 대체하는 티민 (T)와 아주…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단 (31971062, 31900322, 31600322), 장쑤성 자연 과학 재단 (BK20190043, BK20180838), 제약 생명 공학의 국가 핵심 연구소의 연구 기금, 난징 대학 (KF-GN-202004). 중국 장쑤 고등 교육 기관의 자연 과학 재단 (19KJB320003), 소주 시의 생계 및 기술 프로그램 (SYS2019030), 그리고 장쑤성 대학 졸업생을위한 연구 혁신 프로그램 (KYCX19-1981) . 이 작품은 또한 소차우 대학의 당학장에 의해 지원됩니다.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
Referências
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