Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital
Summary
Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.
Abstract
A microscopia intravital (IVM) é amplamente utilizada para monitorar processos fisiológicos e fisiopatológicos dentro da cascata de recrutamento de leucócitos in vivo. O protocolo atual representa um método prático e reprodutível para visualizar a interação com o endotélio leucócito, levando ao recrutamento de leucócitos no tecido derivado do músculo esquelético dentro do organismo intacto do camundongo. O modelo é aplicável a todos os campos de pesquisa que se concentram na ativação de granulócitos e seu papel na doença.
Fornecemos um protocolo passo a passo para orientar através do método e destacar possíveis armadilhas e dificuldades técnicas. O protocolo abrange os seguintes aspectos: configurações experimentais e material necessário, anestesia do camundongo, dissecção do músculo cremaster, bem como cânula traqueal e carótida, gravações ivm e análise off-line. Formatos de dados como leucócitos aderentes, fluxo de rolamento (RF) e fração de fluxo de rolamento (RFF) são explicados detalhadamente e aplicativos apropriados são discutidos. Os resultados representativos dos camundongos mdx deficientes de distrofina são fornecidos na seção de resultados.
O IVM é uma ferramenta poderosa para avaliar o recrutamento de leucócitos em um ambiente in vivo; no entanto, delinear, por exemplo, a função endotelial e leucócito pode exigir uma combinação com configurações ex-vivo, como experimentos de câmara de fluxo. Além disso, o histórico genético de animais de interesse pode influenciar muito o recrutamento de base, exigindo ajuste fino individual do protocolo fornecido. Apesar de suas limitações, o IVM pode servir como uma plataforma para traduzir prontamente achados in vitro em um organismo vertebrado vivo.
Introduction
A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta comumente aplicada no campo da biologia leucócito. O recrutamento de leucócitos segue uma cascata de eventos bem definidos iniciados pela captura de leucócitos, rolamento e adesão à parede endotelial, e finalmente transmigração e extravasação de leucócitos para o local real de inflamação1. Cada passo é mediado e controlado por várias quimiocinas (por exemplo, IL-8/CXCL8), receptores (por exemplo, LFA-1, Mac-1) e moléculas de adesão celular endotelial correspondentes (por exemplo, ICAM-1, VCAM-1 e E-Selectin)2,3. A interação de diferentes locais reguladores, fatores de controle e mediadores da cascata de recrutamento de leucócitos como receptor de produtos finais de glicação avançada (RAGE), molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), liga de motivos C-X-C (CXCL)1/2 e seu receptor CXCR2 foram descobertos utilizando IVM4,5,6,7,8,9.
O método do IVM tem sido descrito para muitos órgãos e tecidos diferentes, como o intestino10,pele11,linfonodos12,o saco de gema embrionária13 e outros. No entanto, o método mais estudado do IVM é o modelo cremaster, descrito pela primeira vez em ratos14. Embora ainda seja usado em ratos15,o método é hoje aplicado principalmente em camundongos devido à alta abundância de diferentes linhas transgênicas. Nosso grupo destacou recentemente o papel potencial do cremaster IVM no campo das muscolopatias inflamatórias como a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) estudando camundongos mdx deficientes de distrofina16. Devido à sua fina composição de fibras entrelaçadas e de fácil acesso, o músculo cremaster representa o músculo candidato ideal a ser estudado como um conjunto de montagem usando microscopia leve ou fluorescente. O recrutamento e extravasação de leucócitos ocorre principalmente em venules pós-capilar, que podem ser facilmente identificados em uma camada muscular contínua no músculo cremaster.
A vantagem da imagem in vivo em comparação com outros ensaios in vitro é seu contexto biológico em um organismo vivo. Ao mesmo tempo, delinear contribuições específicas de células para o recrutamento alterado de leucócitos pode exigir modelos adicionais in vitro, como câmaras de fluxo ou ensaios endoteliais. A combinação de múltiplos métodos produzirá dados mais convincentes. Os cientistas devem estar cientes das limitações do modelo cremaster, pois qualquer manipulação cirúrgica levará ao aumento do tráfico e recrutamento de leucócitos. Portanto, o recrutamento de base é difícil de estimar com este método. Apesar de sua ampla aplicação, o IVM do cremaster pode ser desafiador e uma nova configuração pode levar tempo e recursos para estabelecer. Agora fornecemos um protocolo fácil que ajudará a evitar alguns dos erros comuns no IVM. Além disso, serão discutidas limitações e os métodos complementares serão destacados quando aplicável.
O IVM do cremaster representa uma abordagem ideal a ser implementada no campo dos estudos inflamatórios e infecciosos. Mais especificamente, o modelo cremaster pode ser de alto interesse para os cientistas que estudam biologia muscular esquelética no contexto da doença inflamatória.
Protocol
Representative Results
Discussion
O IVM como método tem sido amplamente utilizado para estudar diferentes tipos de células em diferentes órgãos e tem sido extensivamente descrito e discutido19. O objetivo principal deste estudo é fornecer uma abordagem eficiente para configurar e executar ivm no músculo cremaster. A prática do método produzirá resultados confiáveis e reprodutíveis. Assim, o planejamento e a padronização são fatores-chave para dominar a técnica. Acima de tudo, a técnica é muito dependente de parâm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Ministério Federal alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) 01GL1746E como parte do Consórcio PRIMAL. Os autores reconhecem Britta Heckmann e Silvia Pezer por uma assistência técnica habilidosa.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
Referências
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