इंट्राग्लिस्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन चूहों में क्रेमास्टर मांसपेशी की ल्यूकोसाइट घुसपैठ
Summary
यहां, हम दिखाते हैं कि माउस क्रेमास्टर मांसपेशी के पोस्ट-केशिका वेल्यूल्स पर इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी कैसे करें। आमतौर पर सूजन और सेप्सिस के विभिन्न मॉडलों पर लागू होता है, विशेष रूप से केमोकिन्स और साइटोकिन्स द्वारा प्रेरित, हम अतिरंजित मांसपेशियों की ल्यूकोसाइट घुसपैठ से जुड़े मस्कोलोपैथी के अध्ययन में इसकी प्रासंगिकता को उजागर करते हैं।
Abstract
इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी (आईवीएम) का व्यापक रूप से वीवो में ल्यूकोसाइट भर्ती झरना के भीतर शारीरिक और रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल माउस के अक्षुण्ण जीव के भीतर कंकाल की मांसपेशी व्युत्पन्न ऊतक में ल्यूकोसाइट भर्ती के लिए अग्रणी ल्यूकोसाइट एंडोथेलियम बातचीत की कल्पना करने के लिए एक व्यावहारिक और प्रजनन विधि का प्रतिनिधित्व करता है। यह मॉडल अनुसंधान के सभी क्षेत्रों पर लागू होता है जो ग्रैनुलोसाइट सक्रियण और रोग में उनकी भूमिका पर ध्यान केंद्रित करते हैं।
हम विधि के माध्यम से मार्गदर्शन करने और संभावित नुकसान और तकनीकी कठिनाइयों को उजागर करने के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल में निम्नलिखित पहलुओं को शामिल किया गया है: प्रायोगिक सेटिंग्स और आवश्यक सामग्री, माउस का संज्ञाहरण, क्रेमास्टर मांसपेशी के विच्छेदन के साथ-साथ श्वास और कैरोटिड कैनुलेशन, आईवीएम रिकॉर्डिंग और ऑफ़लाइन विश्लेषण। अनुयायी ल्यूकोसाइट्स, रोलिंग फ्लक्स (आरएफ) और रोलिंग फ्लक्स अंश (आरएफएफ) जैसे डेटा प्रारूपों को विस्तार से समझाया जाता है और उचित अनुप्रयोगों पर चर्चा की जाती है। डिस्ट्रोफिन की कमी वाले एमडीएक्स चूहों से प्रतिनिधि परिणाम परिणाम अनुभाग में प्रदान किए जाते हैं।
आईवीएम वीवो सेटिंग में ल्यूकोसाइट भर्ती का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है; हालांकि, उदाहरण के लिए डिलिनिंग एंडोथेलियल और ल्यूकोसाइट फ़ंक्शन को प्रवाह कक्ष प्रयोगों जैसे पूर्व वीवो सेटअप के साथ संयोजन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, ब्याज के जानवरों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि बहुत बेसलाइन भर्ती को प्रभावित कर सकते हैं, प्रदान प्रोटोकॉल के व्यक्तिगत ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता होती है । अपनी सीमाओं के बावजूद, आईवीएम एक जीवित कशेरुकी जीव में इन विट्रो निष्कर्षों का आसानी से अनुवाद करने के लिए एक मंच के रूप में काम कर सकता है।
Introduction
इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी (आईवीएम) ल्यूकोसाइट जीव विज्ञान के क्षेत्र में आमतौर पर लागू उपकरण है। ल्यूकोसाइट भर्ती ल्यूकोसाइट कैप्चर, रोलिंग और एंडोथेलियल वॉल पर आसंजन द्वारा शुरू की गई अच्छी तरह से परिभाषित घटनाओं के झरने का अनुसरण करती है, और अंत में सूजन1की वास्तविक साइट पर ल्यूकोसाइट्स का ट्रांसग्रेशन और एक्सट्रावेशन। प्रत्येक चरण को विभिन्न केमोकिन (जैसे, आईएल-8/सीएक्ससीएल8), रिसेप्टर्स (जैसे, एलएफए-1, मैक-1) और इसी एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु (जैसे, ICAM-1, VCAM-1 और ई-Selectin)2,,3द्वारा मध्यस्थता और नियंत्रित किया जाता है । विभिन्न नियामक साइटों की बातचीत, ल्यूकोसाइट भर्ती के कारकों और मध्यस्थों को नियंत्रित करने वाले कैस्केड जैसे उन्नत ग्लाइसेशन एंड उत्पादों (क्रोध), इंटरसेलुलर आढ़ती अणु 1 (आईकैम-1), सी-एक्स-सी मोटिफ लिगांड (CXCL) 1/2 और उनके रिसेप्टर CXCR2 को आईवीएम4,,5,,6,,77,8.,का उपयोग करके उजागर किया गया था।
आईवीएम की विधि आंत10,त्वचा11,लिम्फ नोड्स12,भ्रूणयी जर्दी बोरी13 और अन्य जैसे कई अलग-अलग अंगों और ऊतकों के लिए वर्णित की गई है। हालांकि, आईवीएम की सबसे व्यापक रूप से अध्ययन की गई विधि क्रेमास्टर मॉडल है, जिसे पहले चूहों14में वर्णित किया गया था। जबकि अभी भी चूहों15में उपयोग किया जाता है, विधि आजकल मुख्य रूप से विभिन्न ट्रांसजेनिक लाइनों की उच्च बहुतायत के कारण चूहों में लागू होती है। हमारे समूह ने हाल ही में डिस्ट्रोफिन की कमी वाले एमडीएक्स चूहों16का अध्ययन करते हुए डुचेर्न मस्कोलोपैथी जैसे भड़काऊ मस्कोलोपैथियों के क्षेत्र में क्रेमास्टर आईवीएम की संभावित भूमिका पर प्रकाश डाला है । अपनी पतली इंटरबुने और आसानी से सुलभ फाइबर संरचना के कारण, क्रेमास्टर मांसपेशी प्रकाश या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूरे माउंट के रूप में अध्ययन करने के लिए आदर्श उम्मीदवार मांसपेशी का प्रतिनिधित्व करती है। ल्यूकोसाइट भर्ती और एक्सट्रावेशन मुख्य रूप से केशिका वेनुल्स के बाद होता है, जिसे क्रेमास्टर मांसपेशी में निरंतर मांसपेशियों की परत पर आसानी से पहचाना जा सकता है।
अन्य इन विट्रो परखों की तुलना में वीवो इमेजिंग में का लाभ एक जीवित जीव में इसका जैविक संदर्भ है। इसके साथ ही, ल्यूकोसाइट भर्ती में परिवर्तित करने के लिए डेलिनटिंग सेल-विशिष्ट योगदान के लिए अतिरिक्त इन विट्रो मॉडल जैसे फ्लो चैम्बर्स या एंडोथेलियल परख की आवश्यकता हो सकती है। कई तरीकों के संयोजन सबसे समझाने डेटा निकलेगा। वैज्ञानिकों को क्रेमास्टर मॉडल की सीमाओं के बारे में पता होना चाहिए क्योंकि किसी भी सर्जिकल हेरफेर से ल्यूकोसाइट की तस्करी और भर्ती में वृद्धि होगी । इसलिए बेसलाइन भर्ती का अनुमान लगाना मुश्किल है। अपने व्यापक आवेदन के बावजूद, क्रेमास्टर के आईवीएम चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं और एक उपन्यास सेटअप को स्थापित करने में समय और संसाधन लग सकते हैं। अब हम एक आसान प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो आईवीएम में कुछ सामान्य गलतियों से बचने में मदद करेगा। साथ ही, सीमाओं पर चर्चा की जाएगी और जहां लागू हो, मानार्थ तरीकों पर प्रकाश डाला जाएगा।
क्रेमास्टर का आईवीएम भड़काऊ और संक्रामक अध्ययन के क्षेत्र में लागू किए जाने वाले एक आदर्श दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। अधिक विशेष रूप से, क्रेमास्टर मॉडल भड़काऊ रोग के संदर्भ में कंकाल मांसपेशी जीव विज्ञान का अध्ययन करने वाले वैज्ञानिकों के लिए उच्च रुचि का हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईवीएम का उपयोग विभिन्न अंगों में विभिन्न कोशिका प्रकारों का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से किया गया है औरइसे 19पर व्यापक रूप से वर्णित और चर्चा की गई है । इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य क्रेमास?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को प्राइमल कंसोर्टियम के हिस्से के रूप में जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ एजुकेशन एंड रिसर्च (बीएमबीएफ) 01GL1746E द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक निपुण तकनीकी सहायता के लिए ब्रिटा हेकमैन और सिल्विया पेजर को स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
Referências
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