Transcrições de RNA do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) em pacientes por RT-PCR específico

Antonio Mancarella; Francesco  A. Procopio; Tilmann Achsel; Elisa De Crignis; Brian  T. Foley; Giampietro Corradin; Claudia Bagni; Giuseppe Pantaleo; Cecilia Graziosi

doi:10.3791/60511

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Artigo de método

Transcrições de RNA do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) em pacientes por RT-PCR específico

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DOI:

10.3791/60511

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27 de novembro de 2019

Antonio Mancarella¹ , Francesco A. Procopio¹ , Tilmann Achsel² , Elisa De Crignis³ , Brian T. Foley⁴ , Giampietro Corradin⁵ , Claudia Bagni² , Giuseppe Pantaleo¹ , Cecilia Graziosi¹

¹Division of Immunology and Allergy, Lausanne University Hospital, ²Department of Fundamental Neuroscience, University of Lausanne, ³Department of Biochemistry, Erasmus Medical Center, ⁴Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratories, ⁵Department of Biochemistry, University of Lausanne

Neste artigo

Resumo

Grampos de cabelo rna e loops podem funcionar como primers para transcrição reversa (RT) na ausência de primers específicos da seqüência, interferindo com o estudo de transcrições antisense sobrepostas. Desenvolvemos uma técnica capaz de identificar rna específico da cadeia, e nós o usamos para estudar a proteína antisense HIV-1 ASP.

Resumo

Em retrovírus, a transcrição antisense tem sido descrita tanto no vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) quanto no vírus tinfotrópico T humano 1 (HTLV-1). No HIV-1, o gene asp de proteína antisense está localizado na vertente negativa da vv, no quadro de leitura -2, abrangendo a junção gp120/gp41. Na orientação de sentido, o final de 3' do quadro de leitura aberta asp se sobrepõe com gp120 regiões hipervariáveis V4 e V5. O estudo do RNA ASP foi frustrado por um fenômeno conhecido como RT-auto-priming, em que as estruturas secundárias de RNA têm a capacidade de prime RT na ausência da cartilha específica, gerando cDNAs não específicos. O uso combinado de alta desnaturação de RNA com primers reversos biotinylated na reação rt, juntamente com a purificação de afinidade do cDNA em contas magnéticas revestidas de streptavidin, nos permitiu amplificar seletivamente RNA ASP em células T CD4 + derivadas de indivíduos infectados com HIV-1. Nosso método é relativamente de baixo custo, simples de executar, altamente confiável e facilmente reproduzível. A este respeito, representa uma ferramenta poderosa para o estudo da transcrição antisense não só no HIV-1, mas também em outros sistemas biológicos.

Introdução

O gene da proteína antisense (ASP) é um quadro de leitura aberto (ORF) localizado na cadeia negativa do gene do envelope tipo 1 (HIV-1) do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1), abrangendo a junção gp120/gp41¹. Nos últimos 30 anos, vários relatos mostraram que o gene HIV ASP é de fato transcrito e traduzido^2,^3,^4,^5,^6,^7,^8,⁹. Embora as transcrições antisense asp tenham sido totalm....