모든 동물 실험은 LUMC의 동물 실험 위원회의 승인을 받았으며 네덜란드 및 유럽 위원회의 지침에 따라 LUMC의 동물 실험 지침에 따라 실행되었습니다. 참고: 실험 적 설정의 경우, C57BL / 6 마우스는 0.3 x 106 세포 / 200 μL의 농도로 뮤린 결장 종양 MC38로 오른쪽 측면에 피하 접종되었습니다 .PBS (PBS). 10일 후, 종양이 만져졌을 때, 마우스를 PD-L1 차단 항체(클론 MIH-5, 200 μg/마우스, 복막 내 주사)로 처리하거나 모의 처리하였다. 종양은 PD-L1 주사 후 3일 후 절제되었고, 생체내 를 처리하고, 38개의 마커13을사용하여 CyTOF 질량 세포측정에 의해 분석하였다. 1. 데이터 분석을 위한 장비 및 소프트웨어 참고: 2.4 GHz 또는 이와 동등한 에서 컴퓨터 (Windows 7 이상) 및 프로세서 I5를 사용하여 설치된 메모리 RAM 6 GB 및 10 GB의 사용 사용 하드 드라이브 공간. R 패키지 Cytofast는 기존 기능을 사용합니다: 주로 flowCore, pheatmap및 ggplot. R에서 실행할 명령줄이 프로토콜에 포함됩니다. R 지침에 대한 리소스는 https://education.rstudio.com/. Cytofast 패키지를 설치하려면 R(버전 “3.6”)을 시작하고 다음 코드를 입력하여 생체 전도체 버전 3.9를 설치합니다.(!필요네임 스페이스(“BiocManager”, 조용히 = TRUE))설치.패키지(“BiocManager”)BiocManager::설치(“세포 파기”) 다음을 실행하여 패키지가 원하는 환경에서 로드되었는지 확인합니다.라이브러리(사이토패스트) 2. 클러스터 만들기 참고: 사이토파스트와함께 Cytosplore 및 FlowSOM을 두 개의 군집 방법을 선보이기 위해, 종양 미세 환경에서 NK 세포 (CD161+ +)를PD-L1 처리 후 3 일 후에 분석한다. 클러스터링에 의해 수행됩니다.Cytosplore 다운로드 및 Cytosplore를설치 한 후 , 에서 호스팅 <www. Cytosplore.org>,파일을 클릭하여 .fcs 파일(보충 파일 1.1-1.8 [Cytosplore 입력 파일])를 업로드 | CYtosplore에서FCS 파일을 엽니다. 메시지가 표시될 때 고유한 샘플 태그 추가를 클릭하고 쌍곡선 아크신 변환을 위한 보조 팩터를 선택하여 고유한 샘플 태그를 채널로 추가합니다(기본값은 5). H-SNE 실행을선택하고 HSNE 수준 3을 실행하고 맵이 생성될 때까지 기다립니다.참고: 이 단계는 분석 된 셀의 수와 선택한 HSNE 수준에 따라 약간의 시간이 필요할 수 있습니다. 첫 번째 HSNE 수준에서 CD161에 대해 양수인 셀을 확인합니다. CD161+ 셀을 선택하고 선택 영역으로 확대/축소를마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 두 번째 수준에서는 CD161+ 이벤트만 사용하여 세 번째 수준에 도달하는 절차를 반복합니다. 마지막 tSNE 맵이 생성되면 TSNE 맵을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 Cytosplore에 의해 정의된 클러스터를 저장하고 클러스터 저장을 선택합니다. Cytosplore에 의해 프롬프트로 출력 파일의 디렉토리를 선택하고이 디렉토리는 R에 .fcs 파일을로드하는 데 사용되기 때문에이 위치를 기록하십시오.참고: 하위 집합의 수는 시그마 값을 변경하여 수동으로 변경할 수 있습니다. 시그마 값은 기본적으로 30으로 설정됩니다. 그러나 실제 하위 집합 수는 입력에 따라 다릅니다. 여기서 Cytosplore는 각 파일이 하나의 하위 집합을 나타내는 10개의 서로 다른 하위 집합을 감지했습니다. 출력 파일의 이름을 바꿀 때 간단한 이름(문자만 해당)을 사용하면 식별및 추가 처리가 더 쉬워집니다. 저장 을선택하여 출력 파일을 저장합니다.참고: 저장 후, 폴더는 Cytosplore에서 식별 된 클러스터에 해당하는 각 파일과 .fcs 파일Cytosplore에의해 생성되고있다 . 다음 단계는 Cytofast의도움으로 파일을 R로 로드하는 것입니다. 여기서 생성된 출력 파일은 보조 파일 2.1-2.10(Cytosplore 출력 파일)에 제공됩니다. Cytosplore에 의해 생성된 출력 파일을 지정된 기능인 readCytosploreFCS를 사용하여 R로 로드합니다.dirFCS <- "C:\\\사용자\\\\바탕 화면\\\연구"cfData <- 읽기CytosploreFCS (dir = dirFCS, 이름 = "설명") “시간” 및 “백그라운드”와 같은 일부 매개 변수를 제거하여 데이터를 정리합니다. 불필요한 매개 변수와 관련된 열의 위치를 확인하고 행렬에서 제거합니다.cfData@expr)cfData@expr<- cfData@expr[-c(3,4,6,8:10,46:49,51:54)]참고: 생성 된 행렬의 열 이름을 읽고 불필요한 열을 볼 수 있습니다. cfData@expr)를 다시 실행하여 원하는 매개 변수만 가져오도록 합니다. 계보 마커가 먼저 표시되고 기능 마커가 표시되도록 마커를 다시 정렬합니다.cfData@expr<- cfData@expr[, c(1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20,29,40,5,30,33,11,34,14,19,32,28,6,7,4,12,13,17,16,15,21,22,24,25,26,27,38,39)]참고: 2.1.8 단계는 선택 사항입니다. 임상 정보가 포함된 스프레드시트 메타파일을 업로드하여 Cytosplore에서 생성된 데이터에 메타 데이터 파일을 연결합니다(보충파일 3).라이브러리(읽기 슬)메타 <- read_excel ("C:\\\사용자\\\\\바탕 화면\\\sample_id.xlsx")cfData@samples&- 데이터.프레임(메타)참고: Cytosplore에 의해 수행되는 클러스터링이 이제 완료되었습니다. Cytosplore에 대한 대체 클러스터링 옵션은 FlowSOM이며 섹션 2.2에 설명되어 있습니다. 두 클러스터링 단계 중 하나가 수행되면 시각화 단계(섹션 3)를 진행합니다. 클러스터링에 의해 수행됩니다.FlowSOM 다음 명령을 실행하여 R에 FlowSOM을 먼저 설치합니다.(!필요네임 스페이스(“BiocManager”, 조용히 = TRUE))설치.패키지(“BiocManager”)BiocManager::설치(“FlowSOM”)라이브러리(흐름솜) 유사한 방법을 사용하여 flowCore 패키지를 설치하고 다음을 실행하여 환경에 로드합니다.(!필요네임 스페이스(“BiocManager”, 조용히 = TRUE))설치.패키지(“BiocManager”)BiocManager::설치(“흐름 코어”)라이브러리(흐름솜) read.flowSet 함수를 사용하여 CD161+ 이벤트에서 이전에 게이트된 보조 파일 4.1-4.8(FCS FlowSOM 입력)에 제공된 원시 데이터를 R로 로드합니다.fcs_raw <- read.- read.flowSet(path="C:\\\\사용자 이름\\\\\tocluster", 패턴 = ".fcs", 변환 = FALSE, truncate_max_range = FALSE, 시드=123) 적절한 컬럼을 선택하여 관련 생물학적 마커(“배경” 또는 “시간”제거)를 선택하고 아래 코드에 표시된 대로 arcsinh5 방식으로 데이터를 변환합니다(여기서, 열 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, 어떤 생물학적 마커에 해당하지 않음). 아래 함수에서 보조 팩터=5를 선택하여 Cytosplore에이전에 적용한 대로 5의 보조 인자를 적용합니다.fcs_raw <- fsApply(fcs_raw, 함수(x, 보조 팩터=5){(x) <- fcs_raw[1]]@parameters@data$descexpr;lt;- exprs(x)expr<- 아신(expr[,c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,34,35,37,38,51]//공동인자)exprs(x) & exprs반환(x)}) FlowSOM 함수를 사용하여 데이터를 클러스터합니다. FlowSOM 및 Cytosplore를비교하려면 Cytosplore에서이전에 산출한 출력으로 10개의 하위 집합에서 데이터를 클러스터로 클러스터하도록 선택합니다.fsom <- FlowSOM(fcs_raw, transformFunction = FALSE, 배율 = FALSE,scaled.center = FALSE, scaled.scale = FALSE, 무음 = FALSE, colsToUse = c(1:37),nClus = 10, maxMeta = 10, 중요도 = NULL, 시드 = 123)참고: 사용자가 수동으로 변경할 수 있습니다. 식별된 하위 집합 및 샘플 ID에 각 셀을 할당합니다.subset_id<- as.factor(fsom$FlowSOM$맵$매핑[,1])레벨(subset_id) & fsom$메타클러스터링헤드(subset_id) 그룹 할당이 포함된 R(보충 파일 5에서사용 가능)에서 메타데이터 파일을 로드하고 .fcs 파일에 연결합니다.sampleid <- read_excel("C:\\\사용자\\\\\바탕 화면\\\\sample_id.xlsx")샘플ID & lt;- na.omit(샘플id)샘플리드$샘플ID &- as.factor(샘플리드$샘플ID)샘플리드$그룹 & as.factor(샘플id$그룹)sampleid$CSPLR_ST <- as.factor(샘플id$CSPLR_ST)샘플ID 및 lt;- as.data.frame(샘플id)이름(샘플ID)[3] <- “샘플ID”sampleID <- lapply(fsom$FlowSOM$메타데이터, 함수(x){rep(x[1], 각 = 길이(x[1]:x:2]))))))))))))))attr (샘플ID, ‘이름’) <- NULL샘플ID 및 lt;- as.factor(목록 해제(샘플ID) )샘플ID 및 lt;- 데이터.프레임(샘플id)레벨(sampleID) <- 페이스트("ID", 1:dim(샘플ID)[1], 9월="_")df<- data.frame(subset_id, 샘플ID, fsom$FlowSOM$데이터[, c(1:37)])이름 바꾸기 <- data.frame(콜파=fcs_raw[[1]]@parameters@data$desc)colnames(df) <- c("clusterID", "sampleID", 이름 바꾸기$colpar[c(1:37)])df$ 클러스터ID 및 lt;- as.factor(df$ 클러스터ID)df$샘플ID 및 lt;- as.factor(df$샘플ID) 다음 스크립트를 실행하여 FlowSOM에서 얻은 데이터 프레임을 기반으로 cfList를 만듭니다.cfData <- cfList(샘플 = 샘플id,expr = df) 사이토스플로레 분석의 출력과 유사하게 표시되도록 마커를 다시 정렬합니다.cfData@expr<- cfData@expr,c(1,2,34,36,37,10,23,24,31,22,38,15,8,3,27,9,11,28,35,26,14,33,17,20,21,18,25,29,13,30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)]참고: FlowSOM에 의한 클러스터링이 완료되었습니다. 다음으로 클러스터링 출력의 시각화를 수행합니다. 3. 시각화: 후처리 클러스터링 분석 참고: 이 단계는 두 클러스터링 방법에 공통적인 메서드입니다. 따라서 FlowSOM 또는 Cytosplore로클러스터링한 후 수행할 수 있습니다. 히트맵을 만들기 전에 아래 코드와 같이 함수 cellCount를 사용하여 샘플당 카운트 테이블을 생성합니다. 일부 클러스터는 다른 클러스터보다 적은 셀을 포함하므로 함수 셀카운트 내부에 “scale = TRUE”를 지정하여 클러스터당 데이터를 확장하여 샘플 간의 분산을 쉽게 볼 수 있도록 합니다.cfData <- 셀카운트(cfData, 빈도 = TRUE, 규모 = TRUE)참고: 이제 데이터를 시각화 할 수 있습니다. 히트맵으로 시각화합니다.참고:이 패키지의 주요 기능 중 하나는 cytoHeatmaps, 생성된 클러스터의 표현형뿐만 아니라 샘플에 대한 이질성을 시각화하는 데 사용됩니다.cytoHeatmaps (cfData, 그룹=”그룹”, 범례=TRUE) 박스플롯이 있는 시각화참고: 데이터는 함수 cytoBoxplots를 호출하여 정량적 인 방법으로 표현 될 수있다. 이 함수의 출력은 모든 클러스터에 대한 각 샘플의 비율을 나타냅니다. 3.1단계에서 수행된 셀 수를 생성하지만 각 클러스터의 빈도를 얻기 위해 데이터를 확장하지는 않습니다.cfData <- 셀카운트(cfData, 빈도 = TRUE, 배율 = FALSE)사이토박스플롯(cfData, 그룹 = “그룹”) 중앙강도 신호 히스토그램으로 시각화참고: 데이터는 중앙값 강도 신호 히스토그램을 표시하여 시각화 할 수 있습니다. CD45, CD11c 및 CD54의 세 마커의 발현 강도를 시각화합니다. 다음 줄을 호출하여 원하는 마커의 이름을 확인합니다. 마커 이름을 기록하고 msiPlot 함수에 포함합니다.이름(cfData@expr)참고: 여기, CD45, CD11c 및 CD54에 초점을 맞춥니다. 마커의 정확한 철자를 확인하고 필요한 경우 조정합니다.msiPlot (cfData, 마커 = c (“89Y_CD45”, “167Er_CD11c”, “164Dy_CD54”), byGroup=’그룹’)