Целью данной рукописи является представление набросков для комплексных биохимических и функциональных исследований посвяжецких лигазах типа RING E3. Этот многоступенчатый конвейер с подробными протоколами проверяет ферментативную активность проверенного белка и демонстрирует, как связать эту активность с функционированием.
Убиквитинация, как постпереводная модификация белков, играет важную регулятивную роль в гомеостаза хукартотических клеток. Ковалентное присоединение 76 аминокислот ный убиквитин модификаторов к целевому белку, в зависимости от длины и топологии полиубиквитина цепи, может привести к различным результатам, начиная от деградации белка изменения в локализации и / или деятельности модифицированного белка. Три фермента последовательно катализируют процесс убиквитина: e1 убиквитин-активирующего фермента, E2 убиквитин-конъюгирующего фермента, и E3 убиквитин лигазы. E3 убиквитин лигаза определяет специфику субстрата и, следовательно, представляет собой очень интересный предмет исследования. Здесь мы представляем комплексный подход к изучению взаимосвязи между ферментативной активностью и функцией убиквитиновой лиги цигазы типа RING. Этот четырехступенчатый протокол описывает 1) как создать E3 лигаза дефицит мутант через сайт-направленный мутагенез, ориентированный на сохраненный домен RING; 2-3) как изучить активность вездесущности как в пробирке, так и в плану; 4) как связать эти биохимический анализ с биологической значимостью проверенного белка. Поколение мутанта E3, дефицитного лигазе, который все еще взаимодействует со своим субстратом, но больше не уведомляет его для деградации, облегчает тестирование взаимодействий фермент-субстрата in vivo. Кроме того, мутация в сохраненной области RING часто предоставляет доминирующий отрицательный фенотип, который может быть использован в функциональных нокаут-исследований в качестве альтернативного подхода к РНК-интерференции. Наши методы были оптимизированы для исследования биологической роли растения паразитарных нематод эффектор RHA1B, который захватывает принимающей системы убликвиции в клетках растений для содействия тунеядства. При незначительной модификации системы экспрессии in vivo этот протокол может быть применен к анализу любой лиги e3 типа RING независимо от ее происхождения.
Подавляющее большинство E3 убиквитин лигаза принадлежат к RING(Really Interesting New Gene) типа белков. Домен RING-finger был первоначально идентифицирован Freemont et al. 1 и функционально описывается как домен, опосредовающий белково-белковое взаимодействие2. Канонический палец RING представляет собой особый тип цинка координации домена определяется как консенсус последовательность из восьми сохраненных Cys (C) и его (H) специально расположены другие аминокислотные остатки (X), C-X2-C-X9-39-C-X1-3-H-X2-3-C/H-X2-C-X 4-C-X.C.2-C-X.C.2-C-X.C.2-C-X.C.2-C-X.C.2-C-X.C.2-C-X-C-X.C-X.C.2-C-X.C.2-C-X-C-X.C.2-C-X.C.2-C-X-C-X-C-X.C.2-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-2-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-X-C-2-C-X.C.2-C-X-C-X-C Два иона «n2» стабилизируются по остаткам ядра C и H через уникальную топологию «кросс-скобки» с C1/C2 и C/H5/C6, координирующими первый ион «n2» в то время как C3/H4 и C7/C8 связывают второй(рисунок 1A)3,4. В зависимости от наличия C или H в пятом месте координации «n2»были определены два канонических подкласса белков RING-finger: C3HC4 и C3H2C3 (RING-HC и RING-H2, соответственно). Поскольку область RING E3 ubiquitin ligase опосредует взаимодействие между ферментами E2 и субстратами, мутация этих основных остатков C и H, как было показано, нарушает активность лигазы5. Описаны еще пять менее распространенных подклассов лигазаring E3 (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T и RING-G)6. Убиквитин-лигаза типа РИНГ можно дополнительно разделить на простые и сложные ферменты E3. Простое одноподразделение RING E3 ligases содержит как сайт распознавания субстрата, так и домен E2-связывания RING. В отличие от этого, мультисубунит типа RING E3 комплекс либо набирать субстрата или опосредует связывание E2-убиквитин промежуточных к E3 комплекса. Остаток домен RING Lys (ы), который служит основным сайтом вложений убиквитина (ы) для самоубиквитина, также может быть важен для деятельности E3 ligase.
Не все содержащие RING белки функционируют как лигаза E3. Таким образом, биоинформатическое предсказание домена RING-finger и способность к убиквитивании белка, зависящему от Е2, должно быть биохимически проверено и связано с биологической ролью проверенного белка. Здесь мы описываем пошаговый протокол с изложением того, как обнаружить и функционально охарактеризовать ферментативную активность убиквитинов типа RING E3, как in vitro, так и в плане, с помощью подхода мутагенеза, направленного на сайт. Репрезентативные результаты этого трубопровода отображаются для РИНГ типа E3 ligase RHA1B. RHA1B является эффектор белка, вырабатываемого растений паразитической кисты nematode Globodera паллида для подавления иммунитета растений и манипулировать морфологией корневых клеток растений. Чтобы защитить себя от патогенного/ паразитного вторжения, растения развили нуклеотид-связывающей области и лейцина богатых повторить (NB-LRR) типа иммунных рецепторов, которые обнаруживают наличие патогена или паразита и, как следствие, развивать гиперчувствительный ответ (HR), который является одной из форм быстрой и локализованной смерти клеток, происходящих на месте инфекции, чтобы остановить колонизации патогенов. Одним из таких иммунных рецепторов является картофельный белок Gpa2, который придает устойчивость некоторым изолятам G. pallida (полевые популяции D383 и D372)7.
Используя представленные протоколы, было недавно установлено, что RHA1B мешает иммунной сигнализации растений в E3-зависимым образом, ориентируясь на иммунорецептор завода Gpa2 для убликвитиния и деградации8.
Прояснения биохимической и механистической основы РИНГ типа E3 убиквитин лигаза может внести большой вклад в наше понимание их биологического значения в развитии, стресс сигнализации, и поддержание гомеостаза. Протокол описано здесь пары mutagenesis подход с in vitro и в планку функциональных исследований. Вводя одну замещение аминокислот в сохраненных остатках домена RING через прямой мутагенез, полученный E3-дефицитный мутант может быть протестирован параллельно с диким белком типа, чтобы связать ферментативную активность с функциональностью.
Очень важно правильно определить домен RING, в частности его сохраненные Ки и его остатки. Онлайн-инструменты, такие как PROSITE могут быть использованы для этого10. Для дестабилизации домена RING, ответственного за набор фермента E2, Cys обычно заменяется Ser, который является его ближайшей структурной заменой, не способной создать дисульфидную связь, используемую для координации цинка. Lorick et al. показали, что мутация в любом из этих критических остатков Cys отменит убиквитивационную активность одного подразделения ринг-типа E3 ligases5. Хотя некоторые остатки Cys также важны для многоузловых e3 лигазических комплексов, содержащих белки типа RING, из-за многогранной и динамической трехмерной структуры этих комплексов убиквитина и различной роли белков типа РИНГ, единичные замены сэкономленных остатковв домене RING в многоузловой Лиге E3 ligase не были успешными в генерации a ligase.
Для сайта направлены мутагенез, мы обнаружили, что использование небольших переносчиков плазмида и более низких циклов усиления обычно дает более высокую эффективность для мутагенеза. Фермент Pfu можно заменить любой другой высокой точностью и высокой процессивативностью ДНК-полимеразой. Кроме того, если интересующий ген содержит редкие кодоны, другое пятно кишечной палочки, Rosetta, может быть использовано для достижения более высокой урожайности рекомбинантного белка. Кроме того, можно дополнительно оптимизировать как время инкубации, так и температуру индукции IPTG. Более низкие температуры снижают скорость деления кишечной палочки, что может быть благоприятным для выражения определенных белков. Хотя более высокая концентрация IPTG может улучшить экспрессию белка, она также подавляет процессы деления кишечной палочки и не рекомендуется.
Одноразовая субединица типа E3 ligases типа E3 не только функционирует как молекулярная эшафот, которая позиционирует промежуточный E2-Ub в непосредственной близости от субстрата, но и стимулирует активность переноса убиквитина их cognate E2s. Кроме того, учитывая, что комбинация E2/E3 важна для длины и связей поликубиквина цепи, которая определяет судьбу модифицированного субстрата, любое рассмотрение ТИПА RING E3s должно включать в себя их ферментативные партнеры, E2s12. Как показано на рисунке 3B, не все проверенные E2s совместимы с LIgase RHA1B. Таким образом, in vitro убиквитинация анализы должны осуществляться параллельно с несколькими ферментами E2, представляющих различные классы E2, чтобы избежать ложных отрицательных результатов.
Здесь представлена ферментативная проверка in vitro, которая определяет способность самоубиквитинации проверенных белков типа РИНГ. Однако, с небольшими изменениями, этот протокол может быть легко адаптирован для обнаружения in vitro повсеместного субстрата. С этой целью смесь убиквитивания in vitro со ступени 2.15 должна быть дополнена рекомбинантным белком потенциального субстрата E3 ligase (500 нг). После 2 ч инкубации при 30 градусах Цельсия, убиквитинат белок должен быть захвачен с помощью 15 зЛ анти-HA сродства матрицы (если HA-Ub используется, или анти-FLAG сродство матрицы, если FLAG-Ub используется) агитации в течение 2 ч при 4 градусах по Цельсию. После мытья бисера 4x раз с холодным буфером мытья Ub (20 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, 1x PMSF), сбросите все, кроме 40 л буфера и перейдите к шагу 2.16. Сигнал убиквитинации, обнаруженный антителами, специфичными для эпитопа-тегами Ub и субстрата, соответственно, выходящими из молекулярного веса белка субстрата, подтверждает специфичность субстрата/фермента.
Кроме того, идентификация субстратов E3 ligase in vivo обычно связана с многочисленными проблемами, связанными с переходным взаимодействием ферментосубстрата и быстрой деградацией убиквитинаированного целевого белка. Использование E3 лигазы дефицит мутант, который по-прежнему взаимодействует со своей целью, но больше не убиквитинат его13, является очень полезной альтернативой добавлению протеасомального ингибитора MG132, который не всегда достаточно вмешиваться в 26S протеасомы функции.
Общей характеристикой лигаза хавки типа РИНГ а это тенденция к формированию и функционированию в качестве гомо-и/или гетеродимеров. Интересно, что замена в сохраненных остатках домена RING обычно ассоциируется с доминирующим отрицательным фенотипом, где мутировавшая лигаза типа РИНГ блокирует ферментативную активность местного дикого белка13. Таким образом, переэкспрессия ингинговых мутантов в плане может быть альтернативным подходом к выбиванию гена Лигаза E3.
The authors have nothing to disclose.
Наша работа стала возможной благодаря финансовой поддержке конкурсного гранта Инициативы по сельскохозяйственным и продовольственным исследованиям (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) Национального института продовольствия и сельского хозяйства МИНИСТЕРСТВА сельского хозяйства США, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest Potato консорциум, и ISDA Специальность урожая.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |