Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Liposomen und wie diese auf einer Oberfläche immobilisiert und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie massiv parallel abgebildet werden können. Dies ermöglicht die Quantifizierung der Größe und der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen der Population.
Abstract
Die meisten Forschungen, die Liposomen als Membranmodellsysteme oder Arzneimittelzufuhrträger einsetzen, basieren auf Massenauslesetechniken und gehen daher von einer identischen Liposomen des Ensembles aus. Neue experimentelle Plattformen, die Liposomen auf Einteilchenebene beobachten können, haben es jedoch ermöglicht, hochentwickelte und quantitative Studien über Protein-Membran-Wechselwirkungen oder Wirkstoffträgereigenschaften an einzelnen Liposomen durchzuführen. fehlervermeidung durch Ensemble-Mittelung. Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung, Detektion und Analyse einzelner Liposomen mit hilfe eines fluoreszenzbasierten Mikroskopie-Assays vor, der solche Einzelpartikelmessungen erleichtert. Das Setup ermöglicht die massive parallele Abbildung einzelner Liposomen und wird eingesetzt, um die Größe der Intra-Proben und kompositorische Inhomogenitäten aufzudecken. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Vorteile der Untersuchung von Liposomen auf der ebene Liposomenebene, die Grenzen des Assays und die wichtigen Merkmale, die bei der Änderung berücksichtigt werden müssen, um andere Forschungsfragen zu untersuchen.
Introduction
Liposomen sind sphärische Phospholipid-basierte Vesikel, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung stark verwendet werden. Sie fungieren als ausgezeichnete Membranmodellsysteme, da ihre physiochemischen Eigenschaften leicht durch Variation der Lipidkomponenten, aus denen das Liposomen 1,2besteht, manipuliert werden können. Auch Liposomen bilden das am häufigsten verwendete Nanocarrier-System für die Arzneimittelabgabe und bieten eine verbesserte Pharmakokinetik und Pharmakodynamik sowie eine hohe Biokompatibilität3.
Seit vielen Jahren werden Liposomen hauptsächlich mit Massentechniken untersucht, so dass nur Zugang zu ensembledurchschnittlichen Auslesewerten besteht. Dies hat dazu geführt, dass die meisten dieser Studien davon ausgegangen sind, dass alle Liposomen im Ensemble identisch sind. Solche ensemble-gemittelten Werte sind jedoch nur dann korrekt, wenn das zugrunde liegende Dataset gleichmäßig um den Mittelwert verteilt ist, kann jedoch eine falsche und verzerrte Schlussfolgerung darstellen, wenn das Dataset z. B. mehrere unabhängige Ebenen enthält. Darüber hinaus kann die Annahme, dass das Ensemble die gesamte Bevölkerung repräsentieren soll, die Informationen übersehen, die in der Inhomogenität zwischen Liposomen enthalten sind. Erst vor kurzem sind quantitative Assays aufgetaucht, die in der Lage sind, einzelne Liposomen zu untersuchen, die große Inhomogenitäten zwischen einzelnen Liposomen in Bezug auf wichtige physikalisch-chemische Eigenschaften wie Liposomengröße4,Lipidzusammensetzung5,6und Verkapselungseffizienz7aufdecken, was die Bedeutung der Untersuchung von Liposomen auf der Ebene der einzelnen Liposomen unterstreicht.
Ein Forschungsgebiet, in dem die Ensemble-Mittelung der Liposomen-Eigenschaften gezeigt wurde, um Verzerrungergebnisse zu untersuchen, ist die Untersuchung von Liposomengrößenabhängigen Protein-Membran-Wechselwirkungen8,9. Traditionell beschränkten sich Forscher, die solche Prozesse untersuchen, auf die Herstellung von Liposomen mit unterschiedlichen durchschnittlichen Ensembledurchmessern durch Extrusion durch Filter mit unterschiedlichen Porengrößen9. Die Extraktion des Durchmessers einzelner Liposomen mit einzelnen Liposomen-Assays hat jedoch große Populationsüberlappungen ergeben, wobei Liposomen mit 100 nm und 200 nm Filtern extrudiert werden, die bis zu 70 % überlappen in ihrer Größenverteilung4. Dies könnte Massenmessungen von liposomen größenabhängigen Protein-Membran-Wechselwirkungen stark verzerrt10. Durch die Durchführung der Membran-Protein-Interaktionsstudien mit dem einzigen Liposomen-Assay nutzten die Forscher stattdessen die Größen-Polydispersität innerhalb der Probe, so dass sie eine breite Palette von Liposomendurchmessern in jedem einzelnen Experiment untersuchen konnten, was neue Entdeckungen darüber ermöglichte, wie Membrankrümmung und -zusammensetzung die Proteinrekrutierung an Membranen4,11,12beeinflussen können. Ein weiteres Feld, in dem sich die Anwendung einzelner Liposomen-Assays als instrumentelle Seithers erwiesen hat, ist die mechanistische Entwicklung der proteinvermittelten Membranfusion13,14. Für solche kinetischen Messungen hat die Fähigkeit, einzelne Fusionsereignisse zu untersuchen, die Notwendigkeit einer experimentellen Synchronisation des Fusionsprozesses verringert und neue mechanistische Einsichten ermöglicht, die sonst in der räumzeitlichen Mittelung in Massenensemblemessungen verloren gegangen wären. Zusätzlich wurden einzelne Liposomen als Membrangerüst eingesetzt, das die Messung einzelner Proteine ermöglichte und neue Erkenntnisse über die Transmembranproteinstrukturdynamik15,16. Darüber hinaus ermöglichten solche proteoliposome-basierten Setups die Untersuchung der Funktion einzelner Transmembrantransporter17 und porenbildender Proteinkomplexe18 sowie des Mechanismus bioaktiver membranpermeabilisierender Peptide19. Einzelne Liposomen wurden auch als Weichstoff-Nanofluidik mit oberflächenimmobilisierten Einzelliposomen verwendet, die als Kammern für enzymatische Reaktionen in Volumen von 10-19 L dienten, wodurch der Durchsatz und die Komplexität der Screening-Assays mit minimalem Produktverbrauch20erhöht werden.
Kürzlich wurden einzelne Liposomen-Assays zur Charakterisierung von Wirkstoffabgabe-Liposomen auf einer bisher unvorhergesagten Detaillierungsebene verwendet. Die Forscher konnten signifikante Inhomogenitäten in der Menge an Polymer quantifizieren, die an der Oberfläche einzelner Liposomen befestigt ist21. Die einzelnen Liposomen-Assays erlaubten auch Messungen von Liposomen der Arzneimittelabgabe in komplexen Medien wie Blutplasma, die aufzeigen, wie Elemente, die durch Lipidanker an der Liposomenoberfläche verankert sind, anfällig für Dissoziation sein können, wenn Liposomen Bedingungen ausgesetzt sind, die jene imitieren, die während der in vivo Zirkulation nachgeahmt werden22. Insgesamt werden die Vielseitigkeit und Nützlichkeit der einzelnen Liposomen-Assays durch die große Vielfalt der Probleme belegt, die diese Setups angehen, und wir gehen davon aus, dass die Methodik weiter entwickelt wird und in neuen wissenschaftlichen Bereichen Anwendung findet.
Hier beschreiben wir einen fluoreszenzmikroskopischen Einzelliposomen-Assay, der es ermöglicht, einzelne Liposomen in einer Hochdurchsatz-Manier zu untersuchen (Abbildung 1). Um die Methode zu veranschaulichen, verwenden wir sie, um die Größe und kompositorische Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen innerhalb eines Ensembles zu quantifizieren. Der Test verwendet Fluoreszenzmikroskop-Bildgebung von einzelnen Liposomen, die auf einer passivierten Glasoberfläche immobilisiert sind. Wir beschreiben zunächst die kritischen Schritte im Liposomen-Herstellungsprozess, der eine ordnungsgemäße fluoreszierende Liposomenkennzeichnung und Immobilisierung sicherstellt. Anschließend beschreiben wir die Oberflächenvorbereitung, die erforderlich ist, um die Liposomenimmobilisierung zu erleichtern, bevor wir das Verfahren zur Sicherstellung geeigneter Liposomenoberflächendichten skizzieren. Wir besprechen die Mikroskopieparameter, die für den Erwerb hochwertiger Bilder wichtig sind, und zeigen, wie eine einfache Datenanalyse durchgeführt werden kann, die die Extraktion von Liposomengröße und kompositorische Inhomogenität ermöglicht. Dieses generische Protokoll sollte dem interessierten Forscher eine gute Grundlage bieten, um den Assay für sein spezifisches Forschungsinteresse weiterzuentwickeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist wichtig zu beachten, dass wir zwar detailliert beschreiben, wie der einzelne Liposomen-Assay verwendet werden kann, um die kompositorische Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen zu untersuchen, die Plattform jedoch sehr vielseitig ist. Wie bereits in der Einleitung gezeigt und diskutiert, kann das Protokoll leicht angepasst werden, um Aspekte der Membran-Membran-Fusion, Protein-Membran-Wechselwirkungen oder liposomalen Wirkstoffträgercharakterisierung zu studieren. Bei allen wissenschaftlichen Fragen, die an…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Dänischen Rat für unabhängige Forschung [Zuschussnummer 5054-00165B] finanziert.
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
Referências
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