מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ליפוזומים וכיצד ניתן להשתמש בקיבוע על פני השטח ולעבור באופן אינדיבידואלי בצורה מקבילה מסיבית תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבר מאפשר לכמת את הגודל והאחידות בין ליפוזומים בודדים של האוכלוסייה.
Abstract
רוב המחקרים המעסיקים ליפוזומים כמו מערכות מודל ממברנה או ספקיות משלוח התרופות מסתמך על שיטות קריאה-out בצובר ובכך מיסודה מניח את כל ליפוזומים של ההרכב להיות זהה. עם זאת, פלטפורמות ניסיוני חדש מסוגל להתבונן ליפוזומים ברמת החלקיק היחיד הפכו את האפשרות לבצע מחקרים מתוחכמים ביותר וכמותיים על אינטראקציות חלבונים-קרום או הספק הסמים מאפיינים על ליפוזומים בודדים, וכך הימנעות שגיאות מהרכב בממוצע. כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה, גילוי וניתוח של ליפוזומים בודדים באמצעות שיטת מיקרוסקופ מבוססת-פלואורסצנטית, הקלה על מדידות מסוג יחיד-חלקיק. ההתקנה מאפשרת הדמיה בודדים ליפוזומים בצורה מקבילה מסיבית והוא מועסק כדי לחשוף את הגודל הפנים לדוגמה ומלא הומופאות. בנוסף, הפרוטוקול מתאר את יתרונותיו של הלומדים ליפוזומים ברמה האחת, את מגבלות השיטת העבודה, ואת התכונות החשובות שיש לשקול בעת שינוי אותה כדי ללמוד שאלות מחקר אחרות.
Introduction
ליפוזומים הם שלפוחיות מבוססות פוספוליפיד כדוריים המשמשות בכבדות במחקר בסיסי ומיושם. הם מתפקדים כמו מערכות מודל מעולה ממברנה, מכיוון התכונות הפיזיוכימיות שלהם יכול להיות מניפולציות בקלות על ידי שינוי הרכיבים השומנים המרכיבים את ליפופי1,2. גם, ליפוזומים מהווים את מערכת התרופות משלוח הסמים הנפוץ ביותר, מציע פרמקוקינטיקה משופרת, פרמקודינמיקה, כמו גם גבוהה תאימות3.
במשך שנים רבות, ליפוזומים כבר נחקרו בעיקר באמצעות שיטות בצובר, מתן גישה רק לערכי לקרוא ממוצע ההרכב. זה הוביל את רוב המחקרים האלה כדי להניח כי כל ליפוזומים בהרכב זהים. עם זאת, ערכי הרכב-ממוצעים נכונים רק אם ערכת הנתונים הבסיסית מופצת באופן אחיד סביב הערך הממוצע, אך יכולה לייצג מסקנה שקרית ומשוחדת אם ערכת הנתונים כוללת אוכלוסיות עצמאיות מרובות, לדוגמה. בנוסף, בהנחה כי ההרכב מתכוון לייצג את כל האוכלוסייה יכול להתעלם המידע שעמום בתוך האינגניות בין ליפוזומים. רק לאחרונה יש מספר כמותי התפתחה כי הם מסוגלים לחקור ליפוזומים בודד, חשיפת מיני הומומטר גדול בין ליפוזומים בודדים ביחס למאפיינים הפיזיקליים חשוב כולל ליפופי גודל4, הרכב ליפיד5,6, ו-כימוס יעילות7, הדגשת החשיבות של ליפוזומים ברמת ליפו
אזור מחקר שבו אנסמבל ממוצע של ליפוכמה נכסים הוכח לתוצאות הטיה הוא לומד ליפופי מספר אינטראקציות חלבונים-ממברנה תלויי-גודל8,9. באופן מסורתי, החוקרים לומדים תהליכים כאלה הוגבלה להכנת ליפוזומים עם קטרים שונים הממוצע האנסמבל ידי שחול באמצעות מסננים עם מידות נקבוביות שונות9. עם זאת, לחילוץ הקוטר של ליפוזומים בודדים באמצעות ליפולי בודד כמה בחני חשף האוכלוסייה הגדולה חופפים, עם הבלטת ליפוזומים באמצעות 100 ננומטר ו 200 ננומטר מסננים המציגים עד 70% חופפים בהתפלגות גודלם4. זה יכול באופן חמור הטיה מדידות בצובר של ליפוכמה בגודל תלויי חלבון ממברנה אינטראקציות10. ביצוע לימודי האינטראקציה עם חלבון הממברנה באמצעות ליפובי היחיד, החוקרים במקום ניצל את גודל-פולידידיש בתוך המדגם, ומאפשר להם ללמוד מגוון רחב של ליפופי קטרים בתוך כל ניסוי בודד, הקלה תגליות חדשות של איך עקמומיות ממברנה הרכב יכול להשפיע על גיוס חלבונים לממברנות4,11,12 שדה נוסף שבו היישום של ליפולי בודד כמה בחני יש הוכיחה אינסטרומנטלי הוא במחקרים מכניסטיים של חלבון מתווכת ממברנה פיוז’ן13,14. עבור מדידות קינטית כזו, היכולת ללמוד אירועי היתוך בודדים להקל על הצורך בסנכרון ניסיוני של תהליך היתוך, ומאפשר תובנות מכניסטיות חדשות שאחרת אבדו בחישוב ממוצע הזמן הזמני של הרכב בכמויות גדולות. בנוסף, ליפוזומים בודדים שימשו כפיגום קרום, המאפשר את המדידה של חלבונים בודדים ומציע ידע חדשעל הדינמיקה הקונסטרוקטיבית חלבוןמבנית 15,16. יתר על כן, הגדרות כגון פרוטאוליפוכמה מבוסס מבוססי שאפשרו ללמוד את הפונקציה של מובילים בודדים חלבון טראנסממברנלי17 הנקבוביות מכלולי חלבון מתחמי18 , כמו גם את המנגנון של ביואקטיבית ממברנה החדירות-פפטידים19. ליפוזומים בודדים יש גם בשימוש כמו nanofluiאידיקה של חומר רך עם פני השטח ליפוזומים יחיד לשמש לתאי התגובות אנזימטיות בכרכים של 10-19 L, הגדלת התפוקה והמורכבות של בחני ההקרנה הקרנת המוצר עם צריכת מוצר מינימלי20.
לאחרונה, ליפולי בודד מסוימים שימשו לאפיון ליפוזומים של משלוחי סמים ברמת פירוט בעבר לא מראש. החוקרים היו מסוגלים לכמת משמעותי המגון eities בכמות של פולימר מחובר למשטח של ליפוזומים בודדים21. ליפומים בודדים כמה בחני מותר גם מדידות של ליפוזומים משלוח סמים במדיה מורכבת, כגון פלזמה דם, חשיפת כיצד אלמנטים מעוגן ליפופי כמה משטח באמצעות עוגנים שומנים בדם יכול להיות פגיע לדיסוציאציה כאשר ליפוזומים חשופים לתנאים לחקות אותם מנוסים במהלך vivo מחזור22. בסך הכל, צדדיות והשימושיות של ליפופי בודד מתימוכין על ידי מגוון גדול של בעיות כיוונונים אלה המועסקים לכתובת, ואנו לדמיין כי המתודולוגיה תמשיך להתפתח ולמצוא שימוש בתחומים מדעיים חדשים.
כאן אנו מתארים ליפוכי מיקרוסקופ בודד מבוסס על בסיס אחד מסוים המאפשר ליפוזומים בודדים ללמוד באופן תפוקה גבוהה (איור 1). כדי להמחיש את השיטה, אנו משתמשים בו כדי לכמת את הגודל והסדר הפנימי בין ליפוזומים נפרדים בתוך הרכב. המנה מעסיקה הדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ליפוזומים בודדים מקיבוע על משטח זכוכית פסיבי. אנו מתארים תחילה את השלבים הקריטיים בליפומה תהליך הייצור המבטיח ליפובי פלורסנט מתאים לתיוג ולשתק. לאחר מכן, אנו מתארים את ההכנה לפני השטח הדרוש כדי להקל על היפוטיזציה לפני חלוקת ההליך להבטחת ליפומים מתאימים בצפיפות המשטח. אנו דנים בפרמטרי המיקרוסקופיה החשובים לרכישת תמונות באיכות גבוהה ולתיחום כיצד לבצע ניתוח נתונים פשוט, ולאפשר הוצאה של ליפופי גודל והומוגניות. פרוטוקול גנרי זה אמור לספק בסיס טוב לחוקר המעוניין לפתח את הבדיקה הנוספת לעניין המחקר הספציפי שלו.
Protocol
Representative Results
Discussion
חשוב לציין כי בעוד אנו מתארים בפרוטרוט כיצד שיטת ליפוזומים בודדים ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההומוגניות בין ליפוזומים בודדים, הפלטפורמה היא מאוד צדדי. כפי שהוצג בעבר ונדונו במבוא, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם כדי ללמוד היבטים של היתוך קרום קרום, החלבונים-ממברנה האינטראקציות, או ליפוזומ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי [גרנט מספר 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
Referências
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are “Selected” upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
