Количественная флуоресценция на основе однолипосомы анализ для обнаружения композиционной неоднородности между отдельными липосомы
Summary
Этот протокол описывает изготовление липосом и как они могут быть обездвижены на поверхности и изображены индивидуально в массивной параллельной манере с помощью флуоресценции микроскопии. Это позволяет количественно определить размер и композиционную неоднородность между отдельными липосонами населения.
Abstract
Большинство исследований с использованием липосом в качестве мембранных систем модели или носителей доставки лекарств опирается на объемные методы чтения и, таким образом, внутренне предполагает, что все липосомы ансамбля будут идентичны. Тем не менее, новые экспериментальные платформы, способные наблюдать липосомы на уровне одной частицы, позволили провести высокосложные и количественные исследования по белково-мембрановым взаимодействиям или свойствам носителя наркотиков на отдельных липосомых, таким образом избегая ошибок из ансамбля усреднения. Здесь мы представляем протокол для подготовки, обнаружения и анализа отдельных липосом с помощью анализа микроскопии на основе флуоресценции, облегчая такие измерения одной частицы. Установка позволяет для визуализации отдельных липосом в массовом параллельном порядке и используется для выявления внутривыборных размеров и композиционных неоднородностей. Кроме того, протокол описывает преимущества изучения липосом на одном уровне липосомы, ограничения асссея, а также важные особенности, которые необходимо учитывать при его изменении для изучения других исследовательских вопросов.
Introduction
Липосомы являются сферические фосфолипидные пузырьки, которые широко используются как в основных, так и в прикладных исследованиях. Они функционируют как отличные системы мембранной модели, потому что их физиохимические свойства можно легко манипулировать путем изменения липидных компонентов, составляющих липосому1,2. Кроме того, липосомы представляют собой наиболее часто используемую систему доставки лекарств, предлагая улучшенную фармакокинетику и фармакодинамику, а также высокую биосовместимость3.
На протяжении многих лет липосомы в основном изучались с использованием массовых методов, давая только доступ к среднему ансамблю считывание значений. Это привело большинство из этих исследований предположить, что все липосомы в ансамбле идентичны. Однако такие значения, усредненные по ансамблю, являются правильными только в том случае, если базовый набор данных равномерно распределен вокруг среднего значения, но может представлять собой ложное и предвзятое заключение, если набор данных включает, например, несколько независимых групп населения. Кроме того, предполагая, ансамбль означает представлять все население может игнорировать информацию, укрываемую в неоднородности между липосомы. Только недавно появились количественные анализы, которые способны зондировать одиночные липосомы, выявляя большие неоднородности между отдельными липосомы по отношению к важным физикохимическим свойствам, включая липосомы размер4, липидный состав5,6, и эффективность инкапсуляции7, подчеркивая важность изучения липосом на одном уровне липосомы.
Научно-исследовательская область, где ансамбль усреднения липосомсвойства было показано, что результаты смещения изучает липосома-зависимых белково-мембранных взаимодействий8,9. Традиционно, исследователи, изучающие такие процессы, были ограничены в подготовке липосом с различными средними диаметрами ансамбля экструзией через фильтры с различными размерами пор9. Тем не менее, извлечение диаметра отдельных липосом с помощью одной липосомы анализы выявили большие перекрытия населения, с липосомы экструдированные с помощью 100 нм и 200 нм фильтры отображения до 70% перекрытия в их размер распределения4. Это может серьезно смещения объемных измерений липосома размера-зависимых белково-мембранных взаимодействий10. Выполняя исследования взаимодействия мембраны и белка с использованием одного липосома анализ, исследователи вместо этого воспользовался размер-polydispersity в образце, что позволяет им изучать широкий спектр липосом диаметров в рамках каждого одного эксперимента, способствуя новым открытиям о том, как мембранная кривизна и состав может повлиять на набор белка в мембраны4,11,12. Еще одно поле, где применение одной липосомы анализы оказалось полезным в механистических исследованиях белка опосредованного мембранного слияния13,14. Для таких кинетических измерений, способность изучать индивидуальные события слияния смягчила необходимость экспериментальной синхронизации процесса синтеза, позволяя новые механистические идеи, которые в противном случае были бы потеряны в пространственно-временном усреднении сделано в объемных измерений ансамбля. Кроме того, одиночные липосомы были использованы в качестве мембраны эшафот, что позволяет измерения отдельных белков и предлагает новые знания о трансмембранных белков структурной динамики15,16. Кроме того, такие протеолипосомы на основе установок позволило изучить функции отдельных трансмемментов17 и порообразующих белковых комплексов18, а также механизм биоактивных мембранно-пермяковых пептидов19. Однолиповая липосома также использовалась в качестве нанофлюидики мягкой материи с поверхностно-обездвиженных одиночными липосомыми, выступающей в качестве камер для ферментативных реакций в объемах 10-19 л, увеличивая пропускную способность и сложность скрининговых анализов с минимальным потреблением продукта20.
В последнее время, один липосома анализы были использованы для характеристики доставки наркотиков липосомы на ранее unprecendented уровне детализации. Исследователям удалось количественно очислить значительные неоднородности в количестве полимера, прикрепленного к поверхности отдельных липосом21. Один липосомы анализы также позволили измерения доставки наркотиков липосомы в сложных средствах массовой информации, таких как плазма крови, показывая, как элементы, закрепленные на липосом поверхности через липидные якоря могут быть восприимчивы к диссоциации, когда липосомы подвергаются условиям, имитирующим тех, кто испытал во время циркуляции vivo22. В целом, универсальность и полезность одного липосома анализы обоснованы большое разнообразие проблем, эти установки были использованы для решения, и мы предусматриваем, что методология будет продолжать разрабатываться и найти применение в новых научных областях.
Здесь мы описываем флуоресценцию на основе одного липосомы анализ, который позволяет отдельных липосом, которые будут изучены в высокой пропускной форме (Рисунок 1). Чтобы проиллюстрировать метод, мы используем его для количественной оценки размера и композиционной неоднородности между отдельными липосонами в ансамбле. В анализе используется флуоресцентный микроскоп визуализации одной липосомы, обездвиженной на пассивной стеклянной поверхности. Сначала мы описываем критические шаги в процессе изготовления липосом, который обеспечивает надлежащую флуоресцентную маркировку липосом и иммобилизацию. Затем мы описываем поверхностный препарат, необходимый для облегчения липосомного иммобилизации, прежде чем с изложением процедуры обеспечения надлежащей плотности поверхности липосом. Мы обсуждаем параметры микроскопии, важные для получения высококачественных изображений, и разграничив, как выполнять простой анализ данных, позволяющий извить липосому и композиционную неоднородность. Этот общий протокол должен обеспечить хорошую основу для заинтересованного исследователя для дальнейшего развития ассседля для его или ее конкретных научных интересов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важно отметить, что в то время как мы подробно описываем, как один липосомы можно использовать для изучения композиционной неоднородности между отдельными липосомы, платформа очень универсальна. Как было показано ранее и обсуждается во введении, протокол может быть легко адаптирован ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Датским советом независимых исследований (грант No 5054-00165B).
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
Referências
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are “Selected” upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
