En kvantitativ fluorescens mikroskopi-basert enkelt liposome-analyse for registrering av Inhomogeneity mellom individuelle liposomer

Summary

Denne protokollen beskriver fabrikasjon av liposomer og hvordan disse kan immobilisert på en overflate og avbildet individuelt i en massiv parallell måte ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Dette gjør det mulig for kvantifisering av størrelsen og inhomogeneity mellom enkelt liposomer i populasjonen.

Abstract

De fleste forskning ansette liposomer som membran modellsystemer eller narkotika levering bærere er avhengig av bulk lese-ut teknikker og dermed egentlig forutsetter alle liposomer av ensemblet å være identiske. Men nye eksperimentelle plattformer i stand til å observere liposomer på enkelt-partikkel-nivå har gjort det mulig å utføre svært sofistikerte og kvantitative studier på protein-membran interaksjoner eller stoffet carrier egenskaper på individuelle liposomer, Dermed unngår feil fra ensemble snitt. Her presenterer vi en protokoll for å forberede, oppdage og analysere enkelt liposomer ved hjelp av en fluorescens-basert mikroskopi-analyse, noe som letter slike enkelt partikkel målinger. Oppsettet gjør det mulig å avbilde individuelle liposomer på en massiv parallell måte og brukes til å avsløre intra-sample størrelse og inhomogeneities. I tillegg beskriver protokollen fordelene ved å studere liposomer på enkelt liposome nivå, begrensningene til analysen, og de viktige funksjonene som skal vurderes når du endrer den til å studere andre forskningsspørsmål.

Introduction

Liposomer er sfæriske fosfolipid-baserte blemmer som er mye brukt både i grunnleggende og anvendt forskning. De fungerer som utmerket membran modellsystemer, fordi deres fysiokjemiske egenskaper lett kan manipuleres ved å variere lipid komponentene gjør opp liposome^1,2. Liposomer utgjør også det mest brukte legemiddel leverings nanocarrier systemet, som tilbyr forbedrede farmakokinetikken og farmakodynamikk, i tillegg til høy biokompatibilitet³.

I mange år har liposomer først og fremst blitt studert ved hjelp av bulk teknikker, noe som gir kun tilgang til gjennomsnittlige lese-ut-verdier for Ensemble. Dette har ført de fleste av disse studiene til å anta at alle liposomer i ensemblet er identiske. Slike ensemble-gjennomsnitt verdier er imidlertid bare riktige Hvis det underliggende datasettet er jevnt fordelt rundt middelverdien, men kan representere en USANN og partisk konklusjon Hvis datasettet omfatter flere uavhengige populasjoner, for eksempel. I tillegg, forutsatt at ensemblet mener å representere hele befolkningen kan overse informasjonen næret innenfor inhomogeneity mellom liposomer. Bare nylig har kvantitative analyser dukket opp som er i stand til å granske enkelt liposomer, avslører store inhomogeneities mellom individuelle liposomer med hensyn til viktige fysikalsk egenskaper, inkludert liposome størrelse⁴, lipid sammensetning^5,6, og innkapsling effektivitet⁷, fremhever viktigheten av å studere liposomer på single liposome nivå.

Et forskningsområde der ensemble snitt av liposome egenskaper har vist til bias resultatene studerer liposome størrelse avhengig protein-membran interaksjoner^8,9. Tradisjonelt har forskere som studerer slike prosesser vært begrenset til å forberede liposomer med ulike ensemble gjennomsnittlig diameter ved ekstrudering gjennom filtre med ulike pore størrelser⁹. Men å utvinne diameteren til individuelle liposomer ved hjelp av enkelt liposome analyser har avdekket store befolknings overlappinger, med liposomer ekstrudert ved hjelp av 100 NM og 200 NM filtre viser opp til 70% overlapper hverandre i størrelsesfordelingen⁴. Dette kan sterkt bias bulk målinger av liposome størrelse-avhengige protein-membran interaksjoner¹⁰. Utføre membran-protein interaksjon studier ved hjelp av single liposome analysen, forskere i stedet tok fordel av størrelsen-polydispersitet innenfor prøven, slik at de kan studere et bredt spekter av liposome diametere innenfor hvert enkelt eksperiment, tilrettelegging nye funn av hvordan membran krumning og sammensetning kan påvirke protein rekruttering til membraner^4,11,12. Et annet felt der anvendelsen av single liposome analysene har vist seg instrumental er i mekanistisk studier av protein-mediert membran Fusion^13,14. For slike kinetisk målinger, evnen til å studere individuelle fusjon hendelser lindres behovet for eksperimentell synkronisering av Fusion prosessen, slik at nye mekanistisk innsikter som ellers ville ha gått tapt i spatiotemporal i snitt gjort i bulk ensemble målinger. I tillegg har enkelt liposomer blitt brukt som et membran stillas, slik at måling av individuelle proteiner og gir ny kunnskap om transmembrane protein strukturelle dynamikk^15,16. Videre, slik proteoliposome-baserte oppsett gjort det mulig å studere funksjon av individuelle transmembrane transportører¹⁷ og pore-forming protein komplekser¹⁸ samt mekanismen av bioaktive membran-permeabilizing peptider¹⁹. Enkelt liposomer har også blitt brukt som myke materie-nanofluidics med overflate-immobilisert enkelt liposomer som fungerer som kamre for enzymatisk reaksjoner i volumer på 10^-19 L, noe som øker gjennomstrømningen og kompleksiteten i screening-analysene med minimalt produkt forbruk²⁰.

Nylig har enkelt liposome analyser blitt brukt for karakteriserer stoffet levering liposomer på et tidligere unprecendented detaljnivå. Forskerne var i stand til å kvantifisere signifikant inhomogeneities i mengden av polymer festet til overflaten av individuelle liposomer²¹. Singelen liposome analysene også tillatt målinger av stoffet levering liposomer i komplekse medier, slik som blodplasma, avslørende hvordan elementer forankret til liposome overflaten gjennom lipid ankere kan være utsatt for dissosiasjon når liposomer er utsatt for forhold etterligne de opplevde under in vivo sirkulasjon²². Samlet sett er allsidigheten og nytten av enkelt liposome analysene begrunnes med den store variasjonen av problemer disse oppsettene har vært ansatt for å henvende seg, og vi ser for oss at metodikken vil fortsette å bli utviklet og finne bruk i nye vitenskapelige felt.

Her beskriver vi en fluorescens mikroskopi enkelt liposome-analyse som gjør at individuelle liposomer kan bli studert på en høy gjennomstrømming måte (figur 1). For å illustrere metoden bruker vi den til å kvantifisere størrelsen og inhomogeneity mellom individuelle liposomer i et ensemble. Analysen sysselsetter fluorescens mikroskop Imaging av enkelt liposomer immobilisert på en paddivert glass overflate. Vi først beskrive de kritiske trinnene i liposome fabrikasjon prosessen som sikrer riktig fluorescerende liposome merking og immobilisering. Deretter beskriver vi forbehandling som trengs for å lette liposome immobilisering før skisserte prosedyren for å sikre riktig liposome overflate tetthet. Vi diskuterer mikroskopi parametrene viktig for å anskaffe bilder av høy kvalitet og avgrense hvordan du utfører enkle dataanalyse, slik at utvinning av liposome størrelse og inhomogeneity. Denne generiske protokollen skal gi et godt grunnlag for interesserte forsker til å utvikle analysen videre for hans eller hennes spesifikke forskning interesse.

Protocol

1. liposome forberedelse Merk: kort, utarbeidelse av liposomer inneholder vanligvis tre viktige trinn: 1) utarbeidelse av tørre lipid filmer av ønsket lipid sammensetning; 2) rehydrering av lipider for dannelse av liposomer; og 3) kontrollere størrelsen og lamellarity av liposome befolkningen. Veie ut lipider og oppløse dem i tert-butanol: vann (9:1) i hetteglass. Oppløse POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine; MW = 760 g/mol) til 50 mM. Oppløse …

Representative Results

Etter protokollen beskrevet gjør det mulig å image enkelt liposomer i en massiv parallell måte (figur 1). Den vellykkede overflate immobilisering av liposomer bør umiddelbart åpenbare ved tilsetning av liposome løsningen til kammeret (trinn 3,6 i protokollen) som Diffraksjon begrenset intensitet flekker skal vises i bildet (figur 1B og figur 1C). <p class="…

Discussion

Det er viktig å merke seg at mens vi beskriver i detalj hvordan enkelt liposomer analysen kan brukes til å studere inhomogeneity mellom individuelle liposomer, er plattformen svært allsidig. Som tidligere vist og diskutert i innledningen, kan protokollen lett bli tilpasset for å studere aspekter ved membran-membran fusjon, protein-membran interaksjoner, eller liposomal stoffet carrier karakterisering. For noen vitenskapelige spørsmål blir adressert, kraften i singelen liposome analysen ligger i evnen til å oppdage…

Materials

8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65C
Heating plate w. Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ