In vitro stimulation og visualisering af ekstracellulær fælde frigivelse i differentierede humane monocytter-afledte makrofager
Summary
Præsenteret her er en protokol til påvisning af makrofag ekstrellulær fælde (MET) produktion i levende cellekultur ved hjælp af mikroskopi og fluorescens farvning. Denne protokol kan udvides yderligere til at undersøge specifikke MARKEDSført protein markører ved immunofluorescens farvning.
Abstract
Frigivelsen af ekstracellulære fælder (ETs) med neutrofiler er blevet identificeret som en medvirkende faktor til udviklingen af sygdomme relateret til kronisk inflammation. Neutrofileter (NETs) består af et net af DNA, Histon proteiner og forskellige granulater (dvs. myeloperoxidase, elastase og cathepsina G). Andre immunceller, herunder makrofager, kan også producere ETs; men i hvilket omfang dette sker in vivo, og om makrofag ekstracellulære fælder (METs) spiller en rolle i patologiske mekanismer er ikke blevet undersøgt i detaljer. For bedre at forstå rollen af METs i inflammatoriske patologier blev der udviklet en protokol til visualisering af markedsført frigivelse fra primære humane makrofager in vitro, som også kan udnyttes i immunofluorescens eksperimenter. Dette giver mulighed for yderligere karakterisering af disse strukturer og deres sammenligning med ETs frigivet fra neutrofiler. Humane monocyte-afledte makrofager (HMDM) producerer METs ved udsættelse for forskellige inflammatoriske stimuli efter differentiering til M1 Pro-inflammatorisk fænotype. Frigivelsen af METs kan visualiseres ved mikroskopi ved hjælp af en grøn fluorescerende nukleinsyre pletter, der er imperment til levende celler (f. eks SYTOX grøn). Brug af frisk isolerede primære makrofager, såsom HMDM, er fordelagtigt i modellering in vivo inflammatoriske hændelser, der er relevante for potentielle kliniske anvendelser. Denne protokol kan også anvendes til at studere mødte frigivelse fra humane monocyt cellelinjer (f. eks, THP-1) efter differentiering i makrofager med phorbols myristate acetat eller andre makrofag cellelinjer (f. eks murine makrofag-lignende J774A. 1 celler).
Introduction
Frigivelsen af ETs fra neutrofiler blev først identificeret som en medfødte immunrespons udløst af bakteriel infektion1. De består af en DNA-rygrad, som forskellige granulat proteiner med antibakterielle egenskaber er bundet til, herunder neutrofilelastase og myeloperoxidase2. Den primære rolle for neutrofileter (NETs) er at fange patogener og lette deres eliminering3. Men ud over den beskyttende rolle af ETs i immunforsvaret, et stigende antal undersøgelser har også opdaget en rolle i sygdoms patogenese, især under udviklingen af betændelse-drevne sygdomme (dvs. reumatoid arthritis og åreforkalkning4). Frigivelsen af ETS kan udløses af forskellige pro-inflammatoriske cytokiner, herunder interleukin 8 (Il-8) og tumor nekrose faktor Alpha (tnfα)5,6, og den lokaliserede ophobning af ETS kan øge vævsskader og fremkalde en Pro-inflammatorisk respons7. For eksempel, ETs har været impliceret som spiller en kausal rolle i udviklingen af åreforkalkning8, fremme trombose9, og forudsige hjerte-kar-risiko10.
Det er nu anerkendt, at ud over neutrofiler, andre immunceller (dvs., mastceller, eosinofile, og makrofager) kan også frigive ETS på udsættelse for den mikrobielle eller pro-inflammatoriske stimulation11,12. Dette kan være særlig vigtigt i tilfælde af makrofager, i betragtning af deres centrale rolle i udviklingen, reguleringen, og løsning af kroniske inflammatoriske sygdomme. Derfor er det vigtigt at få en større forståelse af det potentielle forhold mellem ET udslip fra makrofager og betændelse-relaterede sygdomsudvikling. Nylige undersøgelser har vist tilstedeværelsen af METs og NETs i intakt menneskelige aterosklerotiske plaques og organiseret trombi13. På samme måde har METs været impliceret i at køre nyreskade gennem reguleringen af inflammatoriske responser14. Men i modsætning til neutrofiler er der begrænsede data om mekanismerne for MARKEDSført dannelse fra makrofager. Nylige undersøgelser med humane in vitro-modeller af MARKEDSført dannelse viser nogle forskelle i de veje, der er involveret i hver celletype (dvs. med hensyn til fraværet af Histon citrulklination med makrofager)6. Men, nogle har vist, at netto frigivelse kan også forekomme i fravær af Histon citrulination15.
Det overordnede mål med denne protokol er at tilvejebringe en enkel og direkte metode til vurdering af frigivelse af markedsøkonomisk behandling i en klinisk relevant makrofag-model. Der er en række forskellige in vitro-makrofag cellemodeller, der er blevet brugt til at studere METs (dvs. den humane monocyt cellelinje i THP-1 og forskellige murine makrofag cellelinjer)16. Der er nogle begrænsninger forbundet med disse modeller. For eksempel, differentieringen af THP-1 monocytter til makrofager normalt kræver en priming trin, såsom tilsætning af phorbols myristate acetat (PMA), som selv aktiverer protein kinase C (PKC)-afhængige veje. Denne proces er kendt for at udløse ET Release4 og resulterer i en lav basal met frigivelse fra THP-1 celler. Andre undersøgelser har fremhævet nogle forskelle i Bioaktivitet og inflammatoriske reaktioner, som er monteret af makrofager in vivo sammenlignet med PMA-behandlede THP-1-celler17.
Tilsvarende, adfærd og inflammatoriske reaktioner af forskellige murine makrofag-lignende cellelinjer ikke helt repræsentere respons spektrum af primære humane makrofager18. Med henblik på at undersøge makrofag ET dannelse i kliniske omgivelser menes primære humane monocyte-afledte makrofager (Hmdm’er) at være en mere relevant model snarere end monocytiske eller murine makrofag-lignende cellelinjer.
ET udslip fra M1 polariserede Hmdm’er er blevet påvist efter eksponering af disse celler for en række forskellige inflammatoriske stimuli, herunder den myeloperoxidaseafledte oxidant hypochlorøse syre (HOCl), PMA, TNFα og IL-86. Beskrevet her er en protokol til polarisere HMDMs til M1 fænotype og visualisere efterfølgende MØDTE frigivelse ved udsættelse for disse inflammatoriske stimuli. PMA anvendes som et incitament for markedsført frigivelse til at lette sammenligninger med tidligere undersøgelser, der har brugt neutrofiler. Vigtigere, HOCl, IL-8, og TNFα bruges også til at stimulere MET frigivelse, som menes at være bedre modeller af det inflammatoriske miljø in vivo. Den mikroskopiske metode til visualisering af ET-udslip indebærer farvning af det ekstracellulære DNA i levende cellekulturer ved hjælp af SYTOX grøn, en uigennemtrængelig fluorescerende grøn nukleinsyre bejdsning, der er blevet anvendt med succes i tidligere neutrofilundersøgelser. Denne metode giver mulighed for hurtig og kvalitativ vurdering af ET udslip, men det er ikke hensigtsmæssigt som en stand-alone metode til kvantificering af ET Release omfang. Der bør anvendes alternative metoder, hvis der kræves kvantificering for at sammenligne omfanget af ET udslip, der skyldes forskellige behandlingsforhold eller indgreb.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generering og visualisering af MARKEDSført dannelse ved hjælp af M1-differentierede Hmdm’er er en ny in vitro-model, der kan være nyttig til at undersøge den potentielle patologiske rolle for disse makrofagstrukturer, især under Kronisk inflammatorisk Betingelser. Det giver en robust protokol til stimulering af primære humane makrofager at frigive METs, som også kan udnyttes i relaterede undersøgelser med humane monocyt eller murine makrofag cellelinjer. Den vellykkede gennemførelse af denne protokol til stimule…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et vedvarende IMPACT tilskud (IPAP201601422) og Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ anerkender også modtagelsen af en australsk postgraduate Award fra University of Sydney. Vi vil gerne takke Mr. pat piansarakit og MS Morgan Jones for hjælp med monocyt isolation og vævskultur.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
Referências
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
