Her beskriver vi en teknik til at kvantificere barriereintegriteten af små tarmorganoider. Det forhold, at metoden er baseret på levende organoider, gør det muligt at foretage sekventiel undersøgelse af forskellige barriereintegritetsmodulerende stoffer eller kombinationer heraf på en tidsløst måde.
Organoider og tredimensionale (3D) cellekulturer gør det muligt at undersøge komplekse biologiske mekanismer og bestemmelser in vitro, som tidligere ikke var muligt i klassiske cellekultur monolag. Desuden monolayer cellekulturer er gode in vitro model systemer, men repræsenterer ikke de. komplekse cellulære differentiering processer og funktioner, der er afhængige af 3D-struktur. Dette har hidtil kun været muligt i dyreforsøg, som er besværlige, tidskrævende og svære at vurdere ved hjælp af optiske teknikker. Her beskriver vi en analyse til kvantitativt bestemme barrieren integritet over tid i levende små intestinal mus organoider. For at validere vores model anvendte vi interferon gamma (IFN-γ) som en positiv kontrol for barrieredestruktion og organoider afledt af IFN-γ receptor 2 knock out mus som en negativ kontrol. Analysen gav os mulighed for at bestemme virkningen af IFN-γ på tarmbarrierenintegritet og IFN-γ induceret nedbrydning af de stramme junction proteiner claudin-2, -7 og -15. Denne analyse kan også bruges til at undersøge virkningen af kemiske forbindelser, proteiner, toksiner, bakterier, eller patient-afledte sonder på tarmbarrieren integritet.
Integriteten af epitelbarrieren opretholdes af det apikale junctional kompleks (AJC), som består af tætte vejkryds (TJ) og tilslutningskrydsproteiner (AJ)1. AJC’s polariserede struktur er afgørende for dens funktion in vivo. Dysregulering af AJC er til stede i forskellige sygdomme og er mistænkt for at være en vigtig udløser af inflammatorisk tarm patogenese. Tab af tarmbarrierefunktion repræsenterer den initierende hændelse af sygdommen. Følgende translokation af kommensal bakterier og inflammatoriske reaktioner er de smertefulde konsekvenser2.
Der er udviklet forskellige in vitro- og in vivo-modeller til at undersøge reguleringen af AJC. Den Transwell assay er baseret på to-dimensionelle (2D) celle monolayers, der var afledt af tumor cellelinjer. Disse systemer er gode til at vurdere ved optiske og biokemiske metoder og muliggøre analyse af mange prøver på samme tid, men mangler mange funktioner i primære celler og differentieringsprocesserne i vivo. Undersøgelse af barriereintegriteten er også mulig i dyremodeller. I terminale forsøg kan virkningerne af specifikke behandlinger in vivo på gennemtrængeligheden af hele tarmen kvantificeres. Men disse modeller kræver et stort antal dyr, og de tillader ikke detaljeret visualisering af de underliggende molekylære processer. I dag forbedret 3D in vitro modeller er tilgængelige, at nøje opsummere celle differentiering processer, celle polarisering, og repræsenterer krypt-villus struktur af tarmen3. Anvendelsen af 3D-tarmorganoider til funktionelle analyser kræver tilpasning af tilgængelige metoder fra 2D-modeller. Her beskriver vi en model til at undersøge tarmbarrierens integritet i levende små tarmmuseorganoider. Analysen blev oprettet for at undersøge virkningen af IFN-γ på barrierens integritet og de respektive tætte junction proteiner8.
I modsætning til den teknik, der anvendes af Leslie4, Zietek5, eller Pearce6, som måler fluorescens efter fjernelse lucifer gul (LY) fra mediet, vores tilgang giver mulighed for kvantificering af luminal optagelse af fluorophore over tid. Derfor repræsenterer resultatet en dynamisk optagelse kinetisk og vores analyse gør det muligt at anvende yderligere stimuli eller hæmmere i løbet af forsøget. Det faktum, at begge analyser måler optagelse udefra basolateral side til indersiden apikale overflade er i klar kontrast til situationen in vivo. I en model beskrevet af Hill et al.7, dette emne blev undersøgt. Ved mikroinjektion af fluorofhore i organoidens lumen blev fluorescensen kvantificeret. Diffusionsretningen repræsenterer den retning, der er til stede i vivo. Den tekniske indsats for mikroinjektion reducerer klart gennemløbet af denne metode. I modsætning til den model, der er beskrevet her, gør mikroinjektionsmetoden det muligt at måle effekter, der kræver biologisk aktivering på den apikale epiteloverflade.
Den organoidbarriereintegritetsmodel, der præsenteres her, er baseret på levende cellemikroskopi og muliggør analyse af dynamiske ændringer inden for AJC-reguleringen over tid. Opsætningen kan anvendes til at teste den farmakologiske virkning af stoffer, der fremkalder og hæmmer tarmbarrierens integritet. Desuden hjælper organoidbaserede modeller med at reducere antallet af dyr, der anvendes til farmakologiske undersøgelser.
Denne analyse tilbyder en teknik til at studere tarmbarrieren integritet i levende organoider. Hele analysen er baseret på små tarmmus organoider og konfokal levende cellemikroskopi. Derfor er det obligatorisk at praktisere korrekt håndtering af organoider på forhånd. Ved isolering kan organoider rutinemæssigt opdeles og opbevares ved kryofrysning3,9. Til denne analyse anbefaler vi at opdele organoiderne 48 timer, før behandlingen påbegyndes. Denne periode giver organoids mulighed for helt at lukke og danne sfæriske strukturer. Såning af organoider til forsøget er et kritisk skridt i analysen. For at reducere individuelle håndteringsvariationer anbefaler vi en rutineprocedure for såningsprocessen. Dette trin er afgørende, og en rutinemæssig håndteringsprotokol reducerer klart eksperimentelle variationer.
Under såningsproceduren (trin 1.7) fragmenteres organoiderne ved gentagne passerer gennem en standard 10 μL pipettespids. Pore størrelsen af dette produkt varierer fra virksomhed til virksomhed. Denne procedure bør praktiseres på forhånd, og resultatet bør altid kontrolleres ved fase kontrastmikroskopi. Når organoiderne har opnået den ønskede størrelse, må proceduren ikke ændres.
Seedningen af organoiderne skal optimeres og tilpasses til den tilgængelige mikroskopiske opsætning. For at kunne kultur og billede organoids i mindst 48 timer, et inkuberet mikroskop kammer er absolut påkrævet. Vælg en chambered coverslip, der passer til dine krav. Ved såning af organoider, sørg for at koncentrere organoids på coverslip overflade. Dette er muligt ved at holde det kammerdæklige dækslip på en ispose i 5 minutter efter placering af cellematrix-organoid suspension. Dette trin er vigtigt at øge kvaliteten af konfokale levende celle imaging. Den aksiale opløsning og arbejdsafstand af konfokale mikroskoplinser er særligt begrænset. Jo tættere du bringer prøven til linsen, jo bedre kan du forestille det, og jo mindre laser energi er nødvendig for at ophidse LY fluorescens.
Phototaxis er et vigtigt spørgsmål, når det kommer til levende celle mikroskopi. Inden for denne analyse udelukker vi denne mulighed. En funktionel AJC kan ses ved udelukkelse af LY fra organoidens lumen (Figur 1, PBS). Tilføjelsen af EGTA i slutningen af forsøget forårsager beslaglæggelse af bivalent ioner, som er cofaktorer for AJC proteiner. LY er kun udelukket fra organoids lumen i vitale organoider med et funktionelt AJC-kompleks. Generelt kan fluorescerende molekyler bruges til at måle integriteten af tarmbarrieren. Vi valgte LY i stedet for andre almindeligt anvendte fluorophores såsom fluorescein mærket dextran, fordi de transporteres transcellulært i tarmceller fra de basale til den apikale rum9. Vi valgte også LY på grund af sin lille størrelse. LY har en molekylvægt på 457 Da og letter derfor undersøgelsen af barrierepermeabiliteten for små molekyler. Fluorescerende molekyle skal vælges afhængigt af det undersøgte videnskabelige spørgsmål. Da der findes fototoksiske AJC-defekter, skal laserexcitationsenergien reduceres, eller billedintervallet forlænges. Den optimale konfokale billeddannelse teknik til denne analyse er spinning disk mikroskopi. Respektive instrumenter muliggør konfokal billeddannelse med kort eksponeringstid ved lav lasereffekt.
Forskellige modeller er allerede blevet udviklet til at studere intestinal barriere integritet in vitro. Mens brugen af analyser baseret på cellelinje monolayers eller eksperimenter in vivo er faldende, organoid-baserede metoder stigende. I modsætning til tidligere beskrevne metoder4,5,6,7– giver vores metode mulighed for kvantificering af barrierefunktionen over tid. Dette gør det muligt at eksponere organoiderne for yderligere stimuli i løbet af forsøget. Her anvender vi EGTA som en anden stimulus i slutningen af eksperimentet som en positiv kontrol.
I modsætning til situationen in vivo, i vores analyse LY tilsættes i mediet og trænger ind i organoid udefra basolaterale epitelsiden mod indersiden apikale lumen. LY er lille og bruges kun til at visualisere tætheden af tarmbarrieren. Molekyler og stimuli, der modulerer det epitellag på den apikale overflade, skal sprøjtes ind i organoidens lumen7. For at reducere den eksperimentelle indsats og for at kunne måle barriereintegriteten af mange organoider på samme tid valgte vi at anvende det fluorescerende farvestof udefra.
Vi brugte analysen til at undersøge funktionen af IFN-γ på den tætte krydset af små tarmmus organoider. Det faktum, at vi var i stand til at analysere barrieren integritet i levende organoider giver fremtidige muligheder for at anvende denne teknik til at beskrive hæmmere for inflammation-induceret opdeling af tarmbarrieren. Stoffer, der modvirker den svækkede barrierefunktion forårsaget af IFN-γ, kan være kandidater til behandling af inflammatoriske tarmsygdomme, hvor nedsat barrierefunktion er en af de patogene faktorer10.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Den Tyske Forskningsfond (DFG) [KFO257, projekt 4 til M.S. og projekt 1 til C.B. FOR2438, projekt 2 til M.S. og E.N. og projekt 5 til C.B. SFB1181 projekt C05 til C.B. TRR241, projekt A06 til N.B.L. og M.S., projekt A03 til C.B., BR5196/2-1 til N.B.L. og BE3686/2 til C.B.] Det Tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) under Det Kliniske Center Erlangen (til M.S., E.N., og M.B.), W. Lutz Stiftung (til M.S.) og Forschungsstiftung Medizin fra Det Kliniske Center Erlangen (til M.S.). Det nuværende arbejde blev udført i (delvis) opfyldelse af kravene for at opnå graden Dr. Med. af Marco Bardenbacher.
48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
Axio Observer.Z1 – spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell strainer | Falcon | 352350 | |
Centrifugation tube 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
Centrifugation tube 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
Microscope coverslip | 24×60 mm | ||
Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |