यहां हम छोटे आंतों के ऑर्गेनॉइड की बाधा अखंडता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं। तथ्य यह है कि विधि जीवित ऑर्गेनॉइड पर आधारित है, विभिन्न बाधा अखंडता की अनुक्रमिक जांच को समय-समाधान तरीके से पदार्थों या संयोजनों को मॉड्यूल करने में सक्षम बनाता है।
ऑर्गेनॉइड और त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृतियां विट्रो में जटिल जैविक तंत्र और विनियमों की जांच की अनुमति देतीहैं, जो पहले शास्त्रीय कोशिका संस्कृति मोनोलेयर में संभव नहीं थीं। इसके अलावा, मोनोलेयर सेल संस्कृतियां इन विट्रो मॉडल सिस्टम हैं, लेकिन जटिल सेलुलर विभेदन प्रक्रियाओं और कार्यों का प्रतिनिधित्व नहीं करती हैं जो 3 डी संरचना पर भरोसा करतेहैं। यह अब तक केवल पशु प्रयोगों में संभव हो पाया है, जो श्रमसाध्य, समय लेने वाली हैं, और ऑप्टिकल तकनीकों द्वारा आकलन करना कठिन है। यहां हम छोटे आंतों माउस ऑर्गेनॉइड रहने में समय के साथ बाधा अखंडता निर्धारित करने के लिए एक परख का वर्णन करते हैं। हमारे मॉडल को मान्य करने के लिए, हमने इंटरफेरॉन गामा (आईएफएन-) को बाधा विनाश और आईएफएन-रिसेप्टर 2 से प्राप्त ऑर्गेनोइड के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लागू किया, जो चूहों को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में खटखटाते हैं। परख ने हमें आंतों की बाधा अखंडता और आईएफएन-प्रेरित गिरावट पर आईएफएन-ए के प्रभाव को निर्धारित करने की अनुमति दी, जो तंग जंक्शन प्रोटीन क्लॉडर्न-2, -7 और -15 के प्रेरित होता है। इस परख का उपयोग आंतों की बाधा अखंडता पर रासायनिक यौगिकों, प्रोटीन, विषाक्त पदार्थों, बैक्टीरिया या रोगी-व्युत्पन्न जांच के प्रभाव की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है।
एपिथेलियल बैरियर की अखंडता को एपिकल जंक्शनल कॉम्प्लेक्स (एजेसी) द्वारा बनाए रखा जाता है, जिसमें टाइट जंक्शन (टीजे) और पालन जंक्शन (एजे) प्रोटीन1शामिल होते हैं। एजेसी की ध्रुवीकृत संरचना वीवो में अपने कार्य के लिए महत्वपूर्ण है। एजेसी का डिस्रेगुलेशन विभिन्न रोगों में मौजूद है और इसमें भड़काऊ आंत्र रोगजनन का एक महत्वपूर्ण ट्रिगर होने की आशंका है । आंतों की बाधा समारोह का नुकसान रोग की शुरुआत की घटना का प्रतिनिधित्व करता है। कॉममेंसल बैक्टीरिया और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का निम्नलिखित स्थानांतरण दर्दनाक परिणाम हैं।
एजेसी के नियमन की जांच के लिए विभिन्न इन विट्रो और वीवो मॉडल विकसित किए गए हैं। ट्रांसवेल परख दो आयामी (2डी) कोशिका मोनोलेयर पर आधारित है जो ट्यूमर सेल लाइनों से प्राप्त किए गए थे। ये प्रणालियां ऑप्टिकल और जैव रासायनिक तरीकों का आकलन करना और एक ही समय में कई नमूनों के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए अच्छी हैं लेकिन प्राथमिक कोशिकाओं की कई विशेषताओं और वीवो में मौजूद विभेदन प्रक्रियाओं की कमीहै । पशु मॉडल में बाधा अखंडता की जांच करना भी संभव है। टर्मिनल प्रयोगों में, पूरी आंत की स्थायित्व पर वीवो में विशिष्ट उपचार ों के प्रभावों को निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, इन मॉडलों को बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता होती है, और वे अंतर्निहित आणविक प्रक्रियाओं के विस्तृत दृश्य की अनुमति नहीं देते हैं। आजकल बेहतर 3डी इन विट्रो मॉडल उपलब्ध हैं जो सेल विभेदन प्रक्रियाओं, सेल ध्रुवीकरण को बारीकी से पुनर्निर्मित करते हैं, और आंत3की तहखाना-विलस संरचना का प्रतिनिधित्व करते हैं। कार्यात्मक विश्लेषणों के लिए 3डी आंतों के ऑर्गेनॉइड के आवेदन के लिए 2डी मॉडल से उपलब्ध तरीकों के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। यहां हम छोटे आंतों माउस ऑर्गेनॉइड रहने में आंतों की बाधा अखंडता की जांच करने के लिए एक मॉडल का वर्णन करते हैं। परख बाधा अखंडता और संबंधित तंग जंक्शन प्रोटीन8पर IFN-के प्रभाव की जांच करने के लिए स्थापित किया गया था ।
लेस्ली4,Zietek5,या Pearce6,जो माध्यम से लूसिफ़ेर पीले (LY) को हटाने के बाद फ्लोरेसेंस उपाय द्वारा लागू तकनीक के विपरीत, हमारे दृष्टिकोण समय के साथ फ्लोरोफोर के चमकदार तेज की मात्रा की अनुमति देता है । इसलिए, परिणाम एक गतिशील तेज गतिज का प्रतिनिधित्व करता है और हमारी परख प्रयोग के दौरान अतिरिक्त उत्तेजनाओं या अवरोधकों के आवेदन को सक्षम बनाता है। तथ्य यह है कि दोनों परख बाहर की ओर से अंदर की ओर से ऊपर की ओर से अंदर की ओर से अपटेक को मापने के लिए वीवो में स्थिति के विपरीत स्पष्ट है । हिल एट अल7द्वारा वर्णित एक मॉडल में, इस विषय का पता लगाया गया था। ऑर्गेनॉइड के लुमेन में फ्लोरोफोर के माइक्रोइंजेक्शन पर, फ्लोरेसेंस की मात्रा निर्धारित की गई थी। प्रसार की दिशा वीवो में मौजूद दिशा का प्रतिनिधित्व करती है। माइक्रोइंजेक्शन का तकनीकी प्रयास स्पष्ट रूप से इस विधि के थ्रूपुट को कम करता है। यहां वर्णित मॉडल के विपरीत, माइक्रोइंजेक्शन विधि उन प्रभावों की माप को सक्षम बनाती है जिन्हें एपिकल एपिथेलियल सतह पर जैविक सक्रियण की आवश्यकता होती है।
यहां प्रस्तुत ऑर्गेनोइड बैरियर इंटीग्रिटी मॉडल लाइव सेल माइक्रोस्कोपी पर आधारित है और समय के साथ एजेसी नियमन के भीतर गतिशील परिवर्तनों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है। सेटअप को आंतों की बाधा की अखंडता को प्रेरित करने और बाधित करने वाले पदार्थों के औषधीय प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड-आधारित मॉडल औषधीय अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करने में मदद करते हैं।
यह परख जीवित ऑर्गेनॉइड के भीतर आंतों की बाधा अखंडता का अध्ययन करने की तकनीक प्रदान करती है। पूरी परख छोटे आंतों के माउस ऑर्गनॉइड और कॉन्फोकल लाइव सेल माइक्रोस्कोपी पर आधारित है। इसलिए ऑर्गनॉइड की उचित हैंडलिंग का अभ्यास पहले से करना अनिवार्य है। अलगाव पर, ऑर्गेनॉइड को नियमित रूप से विभाजित किया जा सकता है और क्रायोफ्रीजिंग3,,9द्वारा संग्रहित किया जा सकता है। इस परख के लिए हम उपचार शुरू होने से पहले ऑर्गेनॉइड 48 एच को विभाजित करने की सलाह देते हैं। यह अवधि ऑर्गेनॉइड को पूरी तरह से बंद करने और गोलाकार संरचनाओं के रूप में मौका देती है। प्रयोग के लिए ऑर्गेनॉइड की सीडिंग परख के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम है। व्यक्तिगत हैंडलिंग विविधताओं को कम करने के लिए, हम सीडिंग प्रक्रिया के लिए एक नियमित प्रक्रिया की सलाह देते हैं। यह कदम महत्वपूर्ण है, और एक नियमित हैंडलिंग प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से प्रयोगात्मक विविधताओं को कम कर देता है ।
सीडिंग प्रक्रिया (चरण 1.7) के दौरान ऑर्गेनॉइड एक मानक 10 μL पिपेट टिप के माध्यम से दोहराव वाले पासिंग से खंडित हो जाते हैं। इस उत्पाद का पोर आकार कंपनी से लेकर कंपनी तक अलग-अलग होता है। इस प्रक्रिया को पहले से अभ्यास किया जाना चाहिए, और परिणाम हमेशा चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जानी चाहिए । एक बार ऑर्गेनॉइड वांछित आकार तक पहुंचने के बाद, प्रक्रिया को न बदलें।
ऑर्गनॉइड की सीडिंग को अनुकूलित और उपलब्ध सूक्ष्म सेटअप के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। कम से कम 48 घंटे के लिए संस्कृति और छवि ऑर्गेनॉइड करने में सक्षम होने के लिए, एक इनक्यूबेटेड माइक्रोस्कोप चैंबर की बिल्कुल आवश्यकता है। एक चैम्बर कवरस्लिप चुनें जो आपकी आवश्यकताओं से मेल खाता है। ऑर्गेनॉइड को सीडिंग करते समय, कवरस्लिप सतह पर ऑर्गेनॉइड को ध्यान केंद्रित करना सुनिश्चित करें। सेल मैट्रिक्स-ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन रखने के बाद 5 मिन के लिए आइस पैक पर चैम्बर कवरस्लिप रखकर यह संभव है। कॉन्फोकल लाइव सेल इमेजिंग की गुणवत्ता बढ़ाने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप लेंस की अक्षीय संकल्प और कार्य दूरी विशेष रूप से सीमित है। करीब आप लेंस के लिए नमूना लाने के लिए, बेहतर आप इसे छवि कर सकते है और कम लेजर ऊर्जा LY फ्लोरेसेंस उत्तेजित करने की जरूरत है ।
जब लाइव सेल माइक्रोस्कोपी की बात आती है तो फोटोटैक्सिस एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। इस परख के भीतर हम इस विकल्प को बाहर करते हैं। एक कार्यात्मक एजेसी ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन(चित्रा 1,पीबीएस) से LY के बहिष्कार से दिखाई देता है। प्रयोग के अंत में ईजीटीए के अलावा बाइवेलेंट आयनों की तनहा का कारण बनता है, जो एजेसी प्रोटीन के लिए सहकारक हैं। LYको केवल एक कार्यात्मक एजेसी परिसर के साथ महत्वपूर्ण ऑर्गनॉइड में ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन से बाहर रखा गया है। सामान्य तौर पर, आंतों की बाधा की अखंडता को मापने के लिए फ्लोरोसेंट अणुओं का उपयोग किया जा सकता है। हमने अन्य आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस जैसे फ्लोरोसेसिन लेबल ्ड्टिन के बजाय LYको चुना क्योंकि उन्हें आंतों की कोशिकाओं में बेसल से एपिकल डिब्बे9तक ले जाया जाता है । हमने अपने छोटे आकार की वजह से भी LY को चुना । LYके पास 457 डीए का आणविक वजन है और इसलिए छोटे अणुओं के लिए बाधा पारगम्यता की जांच की सुविधा प्रदान करता है। फ्लोरोसेंट अणु की जांच किए गए वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर चुना जाना चाहिए । क्योंकि फोटोटॉक्सिक एजेसी दोष मौजूद हैं, लेजर उत्तेजना ऊर्जा को कम करना होगा या इमेजिंग अंतराल बढ़ाया जाना चाहिए। इस परख के लिए इष्टतम कॉन्फोकल इमेजिंग तकनीक डिस्क माइक्रोस्कोपी कताई है। संबंधित उपकरण कम लेजर पावर पर कम एक्सपोजर समय के साथ कॉन्फोकल इमेजिंग को सक्षम करते हैं।
विट्रो में आंतों की बाधा अखंडता का अध्ययन करने के लिए विभिन्न मॉडल पहले ही विकसित किए जा चुके हैं। जबकि वीवो में सेल लाइन मोनोलेयर या प्रयोगों के आधार पर परखों का उपयोग घट रहा है, ऑर्गेनोइड आधारित तरीके बढ़ रहे हैं। पहले4,,5,,6,7वर्णित तरीकोंकेविपरीत, हमारी विधि समय के साथ बाधा कार्य की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देती है। यह प्रयोग के दौरान ऑर्गेनॉइड के अतिरिक्त उत्तेजनाओं के संपर्क की अनुमति देता है। यहां हम एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग के अंत में एक दूसरी उत्तेजना के रूप में EGTA लागू होते हैं ।
वीवो की स्थिति केविपरीत, हमारी परख में LY को माध्यम में जोड़ा जाता है और अंदर के एपिकल ल्यूमेन की ओर बाहर के बासोलेटरल एपिथेलियल साइड से ऑर्गेनोइड में प्रवेश करता है। LY छोटा है और केवल आंतों की बाधा की जकड़न की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अणुओं और उत्तेजनाओं कि apical सतह पर एपिथेलियल परत मिलाना है ऑर्गेनॉइड ल्यूमेन7में इंजेक्शन की जरूरत है । प्रायोगिक प्रयास को कम करने और एक ही समय में कई ऑर्गेनॉइड की बाधा अखंडता को मापने में सक्षम होने के लिए, हमने बाहर से फ्लोरोसेंट डाया लागू करने का फैसला किया।
हमने छोटे आंतों के माउस ऑर्गेनॉइड के तंग जंक्शन पर आईएफएन-एके के फ़ंक्शन की जांच करने के लिए परख का इस्तेमाल किया। तथ्य यह है कि हम जीवित ऑर्गेनॉइड में बाधा अखंडता का विश्लेषण करने में सक्षम थे, आंतों की बाधा के सूजन-प्रेरित टूटने के लिए अवरोधकों का वर्णन करने के लिए इस तकनीक को लागू करने के लिए भविष्य की संभावनाएं प्रदान करता है। ऐसे पदार्थ जो आईएफएन-ए-की वजह से बिगड़ा बैरियर फ़ंक्शन का प्रतिकार करते हैं, वे भड़काऊ आंत्र रोगों के उपचार के लिए उम्मीदवार हो सकते हैं, जिसमें बिगड़ा बाधा कार्य रोगजनक कारकों में से एक है10।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) [KFO257, प्रोजेक्ट 4 से एम.एस. और प्रोजेक्ट 1 से सीबी; FOR2438, परियोजना 2 से एम.एस. और ई.एन. और परियोजना 5 से सीबी; SFB1181 परियोजना C05 से C.B.; TRR241, परियोजना A06 से N.B.L. और एमएस, परियोजना A03 से C.B., BR5196/2-1 से N.B.L. और BE3686/2 से C.B.] ; नैदानिक केंद्र एर्लैंगन (एम. एस., ई.एन., और एम. बी.), डब्ल्यू लुट्ज स्टिफतुंग (एम.एस.) और नैदानिक केंद्र एर्लांगन (एम.एस.) के Forschungsstiftung Medizin के नैदानिक अनुसंधान के लिए अंतःविषय केंद्र (IZKF) । वर्तमान कार्य मार्को Bardenbacher की डिग्री डॉ मेड प्राप्त करने के लिए आवश्यकताओं की (आंशिक) पूर्ति में किया गया था ।
48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
Axio Observer.Z1 – spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell strainer | Falcon | 352350 | |
Centrifugation tube 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
Centrifugation tube 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
Microscope coverslip | 24×60 mm | ||
Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |